Imágenes de bioluminiscencia de neuroinflamación en un ratón transgénico

Resumen

Fuente: Breid, S., et. al. Imágenes de bioluminiscencia de neuroinflamación en ratones transgénicos después de la inoculación periférica de fibrillas de alfa-sinucleína. J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra la imagen de bioluminiscencia de la neuroinflamación en ratones transgénicos, mostrando las reacciones luciferasa-luciferina en astrocitos activados. El protocolo permite la cuantificación no invasiva de la activación astrocítica, lo que ayuda a los estudios sobre la inflamación del SNC y la eficacia terapéutica.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

Modelo animal

1. Intercruza ratones hemizygous Tg(Gfap-luc+/-) con ratones hemicigotos Tg(M83+/-) para generar ratones hemicigotos bigénicos Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) ratones.
2. Genotipar la progenie con PCR en tiempo real para detectar la presencia del transgén que codifica para la alfa-sinucleína humana y con PCR estándar para luciferasa de luciérnaga.
3. Inocular a los animales a la edad de seis a ocho semanas.

Preparación de inóculo

1. Prepare alfa-sinucleína humana recombinante monomérica con la mutación A53T en un tampón de solución salina tamponada (TBS) que contiene 150 mM de NaCl en 20 mM de Tris-HCl (pH 7,2).
2. Preparar la alfa-sinucleína fibrilar para las inoculaciones agitando 3 μg/μL de alfa-sinucleína humana monomérica recombinante en un agitador orbital a 800 rpm y 37 °C durante 5 días.
3. Diluir ensamblajes de fibrillas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta alcanzar una concentración final de 1 μg/μL para inoculaciones intraperitoneales.
4. Fragmente las fibrillas de alfa-sinucleína con un sonicador de varillas durante 1 minuto (40 pulsos de 0,5 s de duración con una pausa de un segundo entre cada pulso y una amplitud ajustada al 50%) en hielo. Para evitar la contaminación por siembra cruzada. Utilice sondas de sonicación limpias para preparar diferentes inóculos.

Inyecciones intraperitoneales

1. Para las inyecciones intraperitoneales, narcotizar a los animales brevemente en una cámara de anestesia por inhalación con isoflurano/oxígeno utilizando un caudal de 2 L/min y el vaporizador ajustado al 2%. Pellizque el dedo del pie del animal y confirme que no retire su extremidad trasera para asegurar una anestesia adecuada.
2. Llene una jeringa hipodérmica desechable de 27 G con 50 μL de fibrillas de alfa-sinucleína sonicadas o PBS.
3. Inyectar directamente en el peritoneo del ratón y evitar penetrar en el intestino delgado o ciego situado detrás de la pared abdominal sujetando al animal en posición dorsal con la cabeza hacia afuera del investigador y hacia abajo a unos 45°. Monitoree a los animales hasta que se hayan recuperado de la anestesia.

Imágenes de bioluminiscencia

1. Image Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) ratones cada 2-4 semanas utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia.
2. Antes de la obtención de imágenes, anestesiar brevemente a los ratones en una cámara de isoflurano/oxígeno con un caudal de 2 L/min y el vaporizador ajustado al 2%. Pellizque el dedo del pie del animal y confirme que no retire su extremidad trasera para asegurar una anestesia adecuada.
3. Afeitar y depilar las cabezas de los ratones con una crema depilatoria. Colorea las orejas de negro con un rotulador no irritante para bloquear la bioluminiscencia inespecífica.
4. Diluya la sal de potasio D-luciferina, el sustrato de la luciferasa, en PBS hasta obtener una solución madre de 30 mg/mL. Consérvelo en alícuotas de 1 mL a -20 °C. Proteja la D-luciferina disuelta de la exposición a la luz.
5. Pesar a los animales antes de la inyección. Calcular el volumen exacto de D-luciferina inyectable de 150 mg/kg de peso corporal. Inyectar por vía intraperitoneal D-luciferina y devolver al animal a la cámara de anestesia.
6. Inicie el software de imágenes. Una vez que el sistema de imágenes haya alcanzado su temperatura de funcionamiento, inicialice el sistema haciendo clic en el botón 'Inicializar' en el panel de control.
7. Seleccione los botones 'Luminiscente' y 'Fotografía'. Establezca el tiempo de exposición en 60 s, el binning en 'Medio', el F/Stop en '1' y la ganancia EM en 'Desactivado'.
8. Confirme que el filtro de excitación está configurado en 'Bloquear' y el filtro de emisión en 'Abierto', y ajuste la altura del sujeto a 1,50 cm.
9. Diez minutos después de la inyección con D-luciferina, coloque a los animales en la placa calefactora de la cámara de imagen y asegúrese de que sus hocicos estén correctamente colocados en la salida de anestesia. Cierre el flujo de isoflurano/oxígeno de la cámara de inhalación y abra el flujo de la cámara de imagen con un caudal de 0,25 L/min y una evaporación del 2%. Cierre correctamente la puerta de la cámara de imágenes.
10. Haga clic en el botón 'Adquirir' para medir la bioluminiscencia, que tarda 60 s.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
27-gauge syringe	VWR	613-4900
Isoflurano	Piramal Healthcare	PZN 4831850
Crema depilatoria	Veet
Secureline lab marker	Neolab	25040
D-luciferin potassium salt	Acris	LK10000	30 mg/mL stock solution
Thermomixer	Eppendorf	5776671
Sonopuls Mini20 sonicator	Bandelin	3648
Sistema de imagen IVIS Lumina II	PerkinElmer<
Living Image 3.0 Software	PerkinElmer
Tg(M83+/-) ratones o B6; C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice	The Jackson Laboratory	4479

td style='width:90pt;'>