Marcaje retrógrado de neuronas motoras de Drosophila mediante colorantes lipofílicos fluorescentes

Resumen

Fuente: Inal, M. A. et. al., Trazado retrógrado de Drosophila neuronas motoras embrionarias utilizando tintes fluorescentes lipofílicos. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra el método de etiquetado retrógrado de las neuronas motoras Drosophila utilizando tintes lipofílicos. El tinte entra en el axón, viaja retrógradamente y etiqueta las neuronas de color verde, lo que permite una visualización detallada de su morfología y proyecciones bajo un microscopio confocal.

Protocolo

1. Equipment and Supplies

1. Materiales para recolectar embriones y entrenar a adultos para poner huevos
   1. Prepare el aparato de filtración cortando un tubo de 50 mL y abriendo un agujero en la tapa para establecer un filtro de malla con poros de 100 μm (Tabla de Materiales) entre el tubo y la tapa.
      NOTA: Alternativamente, se pueden utilizar filtros celulares con poros de 100 μm (Tabla de Materiales) para la etapa de filtración de la recolección de embriones.
   2. Haga placas de agar con premezcla de agar uva (Tabla de Materiales) de acuerdo con las instrucciones enumeradas. Agite brevemente un paquete de la mezcla en polvo en 500 ml de agua destilada a temperatura ambiente (RT, 23 °C) (_dH2O) y cocine la mezcla disuelta en el microondas hasta que hierva vigorosamente. Después de enfriar a 70-75 °C, vierta la mezcla en placas de Petri (60 mm). Una vez que el agar se solidifique, almacene las placas a 4 °C.
   3. Prepare la pasta de levadura mezclando levadura seca activa (Tabla de Materiales) y agua hasta obtener una consistencia de pasta, y manténgala a 4 °C.
   4. Utilice jaulas de recolección de huevos (para placa de Petri de 60 mm, Tabla de Materiales) que proporcionen suficiente flujo de aire.
      
2. Preparación de agujas de disección y micropipetas de inyección de colorante
   1. Prepare la micropipeta de inyección de tinte y la aguja de disección del mismo tubo capilar con un diámetro interior de 0,6 mm y un diámetro exterior de 1,2 mm (Tabla de Materiales). Tire del tubo capilar con un extractor de micropipetas al 7% desde una salida máxima de 170 V (Tabla de materiales) para crear una aguja afilada con un cono de ~0,4 cm de longitud.
   2. Para la inyección de tinte, ajuste la micropipeta con una micropipeta biselada (Tabla de Materiales) mediante una técnica de biselado de burbujas descrita en el manual del instrumento.
      1. En resumen, empapa el molinillo con un agente humectante (Tabla de Materiales) para evitar que el agua 'arrastre' la punta de la aguja. Coloque la aguja en la pinza de micropipeta a 25−30° y baje la punta hasta dos tercios del radio desde el centro de la superficie de biselado. Muela la aguja mientras una jeringa con tubo empuja el aire hacia la aguja para asegurarse de que la micropipeta esté libre de virutas de vidrio.
      2. Marque la micropipeta con un rotulador permanente de punta fina para indicar la posición de la abertura en la punta después del biselado, ya que es difícil localizar la estrecha abertura de la micropipeta que se forma en ángulo.

2. Preparación para la recolección

1. de embrionesAsegúrese de que las moscas adultas (20-40 moscas Canton-S de tipo salvaje o blancas), machos y hembras, se mantengan en condiciones jóvenes (<7 días) y saludables para la recolección de huevos ideal.
   NOTA: Para estimular la puesta de huevos, las moscas se entrenan en su jaula de recolección de huevos un par de días antes de la recolección de huevos en placas de agar veteadas con pasta de levadura al menos una vez al día.

3. Embryo Staging

1. Permita que las moscas pongan huevos durante la noche (o al menos 15 h) en RT para recoger los embriones a las 15 h después de la puesta de huevos (AEL), es decir, la etapa 16, para ver la dendritogénesis de las neuronas motoras de la célula de la esquina anterior (aCC) y del camarón crudo 3 (RP3). Por la mañana, recoge el plato con los huevos.
   NOTA: Los embriones a las 15 h AEL tendrán un intestino distinto de 4 cámaras. Para la obtención de imágenes, las diferentes etapas siguen sus criterios morfológicos específicos y condiciones de envejecimiento.
2. Para recoger los embriones, descoriona los huevos puestos en el plato con lejía al 50% durante 5 min.
3. Una vez que los corions se hayan aclarado, vierta el contenido de la placa a través del aparato de filtración o filtro de células para aislar los embriones. Con una botella exprimible de agua, diluya la lejía que queda en el plato y reúna tantos embriones como sea posible decantando la mezcla en el filtro.
4. Lava los embriones en el filtro 3-4x con más agua o hasta que el olor a lejía se disipe. Retire el filtro del aparato y lave los embriones en otra placa limpia con agua. Decanta el agua de la nueva placa en la que se encuentran los embriones.
5. Prepara una diapositiva de vidrio cubriéndola con dos capas de cinta de vinilo en el centro, formando un rectángulo. Corta un charco rectangular de la cinta con una cuchilla de afeitar. Coloque una tira delgada de cinta adhesiva de doble cara hacia el extremo superior de la piscina, aquí es donde se colocarán los embriones como se muestra en la Figura 1.
6. Utilizando pinzas finas, seleccione individualmente 5-10 embriones a las 15 h AEL y colóquelos en la cinta de doble cara con el lado dorsal hacia arriba. Agregue solución salina de Ringer para insectos a la piscina de disección para proteger los embriones de la desecación (Figura 1).

4. Disección y tinción

1. Usando una aguja de vidrio bajo un microscopio de disección (Tabla de Materiales), corte a través de la línea media de un solo embrión en su superficie desde su extremo posterior hasta su extremo anterior. A continuación, arrastre el embrión desde la membrana vitelina desde la cinta hasta el vidrio (recuadro en la Figura 1). Tenga cuidado de no dañar los tejidos internos del embrión.
2. Voltea los tejidos epiteliales desde el centro y fija el borde epidérmico en la superficie del portaobjetos de vidrio (Figura 1, recuadro).
3. Usando una aguja conectada a un tubo con una abertura de punta de ~300 μm (preparada rompiendo la punta delgada de una aguja de disección), aspire o sople aire para separar y eliminar los troncos traqueales longitudinales dorsales, así como cualquier tripa restante.
4. Use paraformaldehído (PFA) al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para fijar los embriones durante 5 min en RT. Lave los embriones 3 veces con PBS.
5. Tiñe los embriones con 1 μL de anticuerpo anti-rábano picante peroxidasa conjugado con cianina 3 colorante (anti-HRP Cy3) (Tabla de Materiales) en 200 μL de PBS durante 1 h. Lavar los embriones con PBS 3 veces después de la tinción.
   NOTA: El colorante de anti-HRP se puede cambiar en función de los tintes lipofílicos elegidos para la inyección.

5. Llenado de la inyección Micro-pipeta

1. Calentar colorantes lipofílicos (5 mg/mL de 3,3'-dioctadeciloxacarbocianina, perclorato (DiO) o 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindodicarbocianina, sal de 4-clorobencenosulfonato (DiD), Tabla de Materiales) a 60 °C en una mezcla 1:10 de etanol:aceite vegetal antes de su uso.
2. Prepare un portaobjetos de tinte disuelto en aceite para la micropipeta de inyección. Coloque la micropipeta en el soporte capilar (Figura 2, #1). Con el micromanipulador (Tabla de materiales), ajuste la micropipeta para que quede sobre el portaobjetos. A continuación, ajuste la platina para colocar la micropipeta sobre el tinte (Figura 2, #2).
3. Para llenar la micropipeta, use un microinyector (Tabla de Materiales) (Figura 2, #3). Recoja el colorante en la micropipeta ajustando el P_i (presión de inyección) entre 200-500 hPa (hectopascale), el T_i (tiempo de inyección) entre 0,1-0,5 s y P_c (presión de compensación) a 0 hPa durante 5 min (Figura 2, #4).
4. Una vez que se haya recogido el tinte, retire el portaobjetos de tinte y coloque la muestra en la platina del microscopio. A continuación, aumente el Pc a un rango de 20−60 hPa antes de bajar la micropipeta a la muestra para evitar la contaminación del PBS por capilaridad.

6. Inyección de tinte en neuronas

1. Localice el embrión en el centro utilizando el microscopio con lente de objetivo 10x (Tabla de Materiales) y alinee la micropipeta con el embrión.
   NOTA: El tamaño de la gota de tinte se puede ajustar cambiando el Pi o el tamaño de la abertura de la punta de la micropipeta. La gota debe ser de 10-20 μm, que es aproximadamente el ancho de 1 músculo.
2. Cambie la lente del objetivo a una lente de inmersión en agua de 40x (Tabla de Materiales) y sumerja la lente en PBS para ver el embrión.
   1. Utilice microscopía de fluorescencia para verificar la morfología neuronal marcada por Cy3 anti-HRP y determinar el sitio de inyección.
   2. Durante la inyección, use microscopía de campo claro para ver la gota de tinte. Cuando el embrión esté enfocado, cambie la posición de la micropipeta para hacer un contacto suave con la punta del axón de interés (p. ej., aCC, RP3).
   3. Deja caer el tinte en un hemisegmento abdominal derecho (A2−A6) en la unión neuromuscular de aCC o RP3 (Figura 3) con DiD o DiO, utilizando las neuronas marcadas por Cy3 anti-HRP. Usando el control manual (ratón; Figura 2, 5) libere el tinte y retire la micropipeta después de dejar caer el tinte con el micromanipulador y pase al siguiente sitio de inyección.
      NOTA: A diferencia de otros tintes (por ejemplo, amarillo Lucifer, calceína) que se propagan a las células vecinas a través de uniones de brecha, los tintes lipofílicos se asocian con las membranas celulares y no se transfieren a las vecinas. Sin embargo, debido al tamaño relativamente grande de la gota de tinte, esta técnica también da como resultado el marcaje de los músculos asociados (Figura 3A).
3. Incubar la muestra en RT durante 1 h después de la gota de tinte antes de la imagen.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí antes del montaje, y la muestra se puede mantener a 4 °C durante la noche. Los tintes lipofílicos también se pueden administrar mediante iontoforesis si se dispone de un amplificador intracelular de acoplamiento directo (CC).

7. Imágenes con un Microscopio

1. ConfocalRetire la cinta adhesiva de doble cara y la cinta de vinilo del portaobjetos de vidrio con la ayuda de pinzas.
2. Prepare un cubreobjetos (22 x 22 mm2 No.1 cover glass) con una pequeña cantidad de grasa al vacío (Tabla de Materiales) en las cuatro esquinas y colóquelo cuidadosamente sobre la muestra, evitando burbujas de aire. Elimine cualquier exceso de PBS con limpiadores de tareas.
3. Empuje hacia abajo el cubreobjetos para ajustar la distancia de trabajo entre la lente del objetivo y la muestra. Sella completamente los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas.
4. Imagen con aumentos de 10x y 100x utilizando un microscopio confocal.

Resultados

Figura 1: Configuración de la piscina de disección. La cámara azul que se ve en la corredera de vidrio está creada con cinta de vinilo que mantiene los topes en el interior. La cinta adhesiva de doble cara sujeta los embriones...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10x objective lens	Nikon		Plan
40x water-immersion lens	Nikon		NIR Apo
Capillary tubing	Frederick Haer&Co<
Confocal microscope<	N/A	Dragonfly Unidad
Cover glass	Corning<	22x22 mm Square #1
DiD	ThermoFisher	V22886
DiI	ThermoFisher	V22888<
DiO	ThermoFisher	V22887
Dissecting microscope	Nikon	N/A	SMZ-U
Cinta adhesiva de doble cara	Scotch	665
Dow corning grasa de alto vacío	Fisher Sci.	14-635-5D
Dumont #5 Capabilities	Fine Science Tools	11252-20
Egg collection cage	FlyStuff	59-100
FemtoJet 5247	Eppendorf	discontinued	FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
Micromanipulator	Sutter<
Biseladora de micropipetas	Sutter	BV-10-B
Needle puller	Narishige	PC-100
Paquetes de premezcla de polvo de agar uva Nutri-fly	FlyStuff	47-102
Nylon net filter<
Paraformaldehyde 16% solution, EM grade	Electrónica Microscopy Sciences	15710	Any EM grades
PBS	Roche	11666789001	Vendido en sigmaaldrich, solución 10x en caja
Photo-Flo 200	Kodak	146 4510	Wetting agent
Microscopio de fluorescencia vertical	Nikon	N/A	Eclipse Ci with a LED light source
Cinta aislante de vinilo	Scotch	6143
VWR Cell strainers	VWR	10199-659
Yeast	FlyStuff<	Levadura seca activa (RED STAR)

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