Microscopía de inmunofluorescencia de células neurales diferenciadas de células derivadas de sangre periférica

Resumen

Fuente: Becker-Kojić, Z. A., et. al., Generación libre de transgénicos de células neuronales derivadas de la sangre. J. Vis. Exp. (2021)

El video muestra un protocolo para preparar células neuronales derivadas de células de sangre periférica reprogramadas para microscopía de fluorescencia, mostrando distintos tipos de células y etapas de desarrollo a través de imágenes de inmunofluorescencia.

Protocolo

1. Análisis de microscopía de inmunofluorescencia de células neuronales derivadas de la sangre
   1. Cultiva las células durante 16 días y elimina los medios.
      1. Incubar con fijador precalentado que consiste en 75 mL de agua estéril, 4 g de paraformaldehído. Agregue 10 N NaOH según sea necesario y revuelva hasta que la solución se aclare. A continuación, añada 10 mL de PBS 10x, 0,5 mL de MgCl₂, 2 mL de EGTA 0,5 M y 4 g de sacarosa. Ajuste a pH 7.4 con HCl 6 N y lleve a 100 mL de agua estéril durante 15 min.
      2. Desecha el fijador y lava las celdas 3 veces durante 5 min cada vez. Agregue inmediatamente una solución Triton X al 0,3% recién hecha y permeabilice las células durante 5 minutos. Lavar 3 veces con PBS y añadir una solución de bloqueo hecha por PBS y 5% BSA.
      3. Bloquea las celdas a temperatura ambiente en una placa basculante durante 1 hora.
      4. Prepare diluciones apropiadas de anticuerpos en 1% BSA/PBS e incube las células con diluciones de anticuerpos en una placa basculante durante 1.5 h a temperatura ambiente. Lave las células 3 veces con PBS durante 5 minutos cada una, incube las células con DAPI y monte los cubreobjetos con medios de montaje para su visualización en un microscopio.
         NOTA: Los anticuerpos marcados directamente utilizados en este experimento se enumeran en la Tabla de Materiales.

Materiales