Análisis de estructuras amiloides en una sección de tejido mediante microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida

Resumen

Fuente: Nyström, S., et al., Imágenes de tejidos amiloides teñidos con oligotiofenos conjugados luminiscentes mediante microscopía confocal hiperespectral e imágenes de fluorescencia de por vida. J. Vis. Exp. (2017).

Este video demuestra el análisis de estructuras amiloides con microscopía de imágenes de fluorescencia o FLIM, utilizando el tinte hFTAA para revelar núcleos compactos como azul/verde y periferias inestables como rojo/amarillo en imágenes codificadas por colores, lo que refleja la organización del amiloide.

Protocolo

1. Preparación de muestras de tejido

NOTA: Muchos tipos de tejidos pueden ser visualizados utilizando el ácido heptámero-formil tiofeno acético (hFTAA) como marcador amiloide. El hFTAA es sensible a la conformación de agregados. Por lo tanto, es preferible que la tinción se realice en agregados no interrumpidos sin exposición a epítopos. La calidad espectral óptima se logra si la fijación del tejido se mantiene al mínimo. Por lo tanto, se prefiere el material fresco congelado, fijado suavemente en etanol en el momento de la tinción. Sin embargo, también es posible detectar depósitos de amiloide en tejidos que se han fijado con, por ejemplo, formol. Por lo general, la hFTAA penetra bien en el tejido. Seleccione un grosor de muestra que sea compatible con la técnica de imagen prevista.

1. Si se utilizan secciones fijadas en formol e incrustadas en parafina, deben desparafinarse en xileno durante la noche. Luego, sumerja las secciones en baños consecutivos de etanol al 99%, etanol al 70%,_dH2Oy solución salina tamponada con fosfato (PBS), 10 min en cada uno. Deje que las secciones de tejido se sequen en condiciones ambientales.
   Precaución: El xileno siempre se manipula en una campana de gases químicos. El xileno y otros disolventes orgánicos son perjudiciales.
   1. Descongelar criosecciones a temperatura ambiente. Fije las secciones de tejido en formalina al 10% durante la noche y rehidrátelas sumergiéndolas en baños consecutivos de etanol al 99%, etanol al 70%,_dH2Oy PBS, 10 min en cada uno. Deje que las secciones de tejido se sequen en condiciones ambientales.
2. Añade gotas de la solución de trabajo hFTAA (aproximadamente 200 μL) a las secciones de tejido para cubrirlo. La gota debe permanecer en su lugar por la tensión superficial. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente para teñir.
3. Enjuague la solución de tinción con 500 μL de PBS usando una pipeta y luego sumerja el portaobjetos en el baño de PBS durante 10 min. Deje que la sección se seque en condiciones ambientales.
4. Montura usando el medio de montaje de fluorescencia. Deje que el medio de montaje se asiente durante la noche.

2. FLIM
NOTA: El microscopio confocal está equipado con una unidad de microscopía de imagen de fluorescencia (FLIM).

1. Configure los siguientes parámetros para el microscopio confocal: estenopeico, 20; longitud de onda de excitación, 490 nm; intensidad del láser, 0,5% (correspondiente a una potencia media de 7,5 μW). Utilice láseres pulsados a 40 MHz.

2. En el software FLIM, configure el conteo de fotones a más de 550 nm. En la ventana Parámetros de visualización, siga el recuento de fotones hasta que el recuento máximo sea de alrededor de 4.000 recuentos de fotones.

3. Guarde el archivo y expórtelo como una imagen de conteo de fotón único (SPC).

4. Ajuste los datos a un decaimiento exponencial de 2 componentes en el software FLIM. Un ajuste que dé un χ² < 2 es bueno. El valor en el eje Y es el número de recuentos para la vida útil dada.

5. Seleccione un umbral para los recuentos que incluir, por ejemplo, 100. Código de color por T1 y seleccione el rango de vida útil. La descomposición depende de la estructura amiloide a la que se une el hFTAA. Se han observado tiempos de vida de fluorescencia entre 300 y 1.000 ps. Guarde el archivo.

6. Exporte los datos sin procesar utilizando las opciones de exportación y guarde los datos deseados en una nueva carpeta.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
hFTAA/Amytracker545	Ebba Biotech
Medio de montaje Dako fluorescene	Agilent technologies	GM304
LeicaDM6000	Leica
Lumen 200	Prior
Sistema Spectraview	ASI spectspect Imágenes rales
Spectraview software	ASI Imágenes espectrales		& #160;
LSM780	Zeiss
Zen 2010b v6.0 software	Zeiss
FLIM system	Becker & Hickl
Ar/ML 458/488/514	Zeiss
Láser sintonizable en sintonía	Zeiss

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