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1.Live Image Recording
- Preparando Celdas para Imágenes en Vivo
1. Cultivo de células neuronales hipotalámicas WT y CCR5-/- que expresan el transportador de glucosa 4 marcado con proteína de fluorescencia verde (GFP-GLUT4) en el cubreobjetos de vidrio # 1.5 (o 0.17 mm de espesor) que ha sido prerrecubierto con poli-D-lisina en la placa de 6 pocillos.
2. Retire con cuidado los cubreobjetos con neuronas con pinzas y colóquelo en los portaobjetos de vidrio con precaución.
3. Elimine el exceso de medio/líquido con toallitas delicadas. Dobla las toallitas dos veces y colócalas con cuidado encima del cubreobjetos. Presione suavemente las toallitas sin mover el cubreobjetos.
PRECAUCIÓN: No presione el cubreobjetos contra el portaobjetos de vidrio con fuerza. El propósito de este paso es garantizar que el cubreobjetos no se mueva o se desvíe durante la adquisición de imágenes debido a la fuerza de flotación.
4. Coloque los cubreobjetos y portaobjetos en la platina del microscopio de deconvolución, con el cubreobjetos hacia abajo, y asegúrelos correctamente. Este paso es para garantizar que la posición de la corredera permanezca constante para que los usuarios puedan rastrear el mismo conjunto de celdas objetivo más adelante.
5. Observe las células de neuronas hipotalámicas WT y CCR5-/- con una lente objetivo de inmersión en aceite de 60x/1.42 NA.
6. Trate las muestras de células seleccionadas con CCL5 (10 ng/mL) o insulina (10 U/mL) durante un min. Agregue 1,5 μL de insulina diluida en el borde del cubreobjetos.
7. Visualice y registre las muestras de células seleccionadas inmediatamente. Programe el software de grabación de video para grabar durante 30 minutos.
2. Deconvolution microscopy and analysis
NOTA: Esta parte del protocolo requiere el uso de un microscopio de deconvolución y software especializado para el análisis.
1. Encienda el sistema de imágenes, permita que la platina del microscopio se inicialice correctamente y luego encienda la fuente de luz LED.
2. Agregue aceite de inmersión (índice de refracción 1.520 para muestras vivas a 37 °C) en una lente de objetivo de 60x 1.42 NA. Coloque el portaobjetos de muestra en el microscopio con el cubreobjetos orientado hacia la lente del objetivo y asegure el portaobjetos correctamente.
3. Utilice iluminación de campo claro o fluorescencia para identificar las células objetivo. Ajuste el enfoque hasta que se puedan observar claramente las células objetivo. No mueva la lente del objetivo fuera del área del cubreobjetos para evitar marcas de arañazos innecesarias.
4. Identifique el transportador de glucosa 4 conjugado con proteína de fluorescencia verde (GFP-GLUT4) por la señal GFP. Identifique las celdas objetivo deseadas para la adquisición de imágenes. La posición seleccionada de la celda objetivo se puede memorizar para futuras referencias (consulte la Figura 1).
5. Configure los parámetros experimentales adecuados (incluyendo el número de píxeles, la longitud de onda de excitación, el porcentaje de transmisión, el tiempo de exposición, el grosor de la pila, el intervalo de tiempo y el tiempo total de imagen) en cada celda objetivo. Para este experimento, el número de píxeles de la imagen se estableció en 512 x 512 (se puede establecer en 1.024 x 1.024 para una resolución más alta) para señales GFP. El tiempo de exposición se fijó entre 0,025 y 0,05 s por cada 5 min. Los ajustes laterales menores de x, y y z se pueden controlar mediante el software recomendado (consulte la tabla de materiales).
6. Establece el parámetro de exposición en aproximadamente 2,000 a 3,000 recuentos para lograr la máxima intensidad de píxeles. Para minimizar el fotoblanqueo de fluorescencia, reduzca el porcentaje de transmisión de luz de excitación tanto como sea posible mientras mantiene el tiempo de exposición por debajo de 1 s. Repita estos pasos para cada canal de fluorescencia adicional y cada área individual de interés.
7. Establece el límite superior e inferior de la pila Z en cada celda objetivo. Esto se puede lograr moviendo la platina del microscopio hasta que la parte superior e inferior de la célula objetivo estén ligeramente desenfocadas. Los usuarios pueden ajustar la resolución del eje Z estableciendo el número de imágenes entre el límite superior e inferior (lo que se puede hacer estableciendo la distancia entre cada imagen).
8. Las pilas de imágenes fueron desconvolucionadas y luego analizadas con la ayuda del software respectivo: Velocity de PerkinElmer en este caso.
