Análisis microscópico de sinapsis en cortes de hipocampo de ratón mediante inmunofluorescencia

Abstract

Fuente: McLeod, F., et al. Evaluación de la densidad de sinapsis en cortes de cerebro de roedores hipocampales. J. Vis. Exp. (2017).

Este video muestra un método para visualizar marcadores sinápticos en cortes de cerebro del hipocampo utilizando el análisis de inmunofluorescencia confocal. Los cortes se inmunotiñen con anticuerpos primarios dirigidos a marcadores presinápticos y postsinápticos, seguidos de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos. A continuación, los marcadores marcados se visualizan mediante microscopía confocal para evaluar la arquitectura sináptica a través de su colocalización.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Preparación de corte de hipocampo agudo

Retire el cerebro del ratón lo más rápido posible, utilizando una espátula y unas tijeras afiladas para cortar el cráneo, y colóquelo en líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF, ~100 mL) congelado y oxigenado (95% O₂, 5% CO₂), con alto contenido de sacarosa.

2. Coloque el cerebro del ratón en una placa de Petri y extraiga el cerebelo y una pequeña sección de la corteza frontal con un bisturí antes de hemiseccionar la línea media del cerebro.
3. Coloca los dos hemisferios en el lado que acabas de cortar y pega cada hemisferio en la platina de un vibrátomo.
4. Corta secciones de 200 - 300 μm de espesor de la región completa de interés. En el caso del hipocampo, se deben obtener aproximadamente 3 a 4 cortes por hemisferio.
5. Utilizando una pipeta Pasteur de plástico, transfiera las rodajas a una cámara sumergida en ACSF oxigenado (95% O₂, 5% CO₂). Mantener a 34 °C durante 30 min.
   NOTA: En esta etapa, los cortes se pueden tratar con agentes farmacológicos activos, como las proteínas recombinantes Dickkopf-1 (Dkk1), agregando los agentes a la cámara de corte.
6. Con un pincel, retire las rodajas de la cámara, colóquelas en una placa de 24 pocillos y fíjelas durante 20 minutos a 1 h en 4% de paraformaldehído (PFA)/4% de sacarosa a temperatura ambiente (RT).
   Precaución: El PFA es tóxico, use la protección adecuada.
7. Lave las rodajas tres veces en solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS, 10 min cada una).
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí durante 1 - 2 días, siempre y cuando las rebanadas se mantengan a 4 °C en 1X PBS.

2. Inmunofluorescencia para marcadores sinápticos

NOTA: Las recetas de todos los tampones utilizados se pueden encontrar en la Tabla 1.

1. En los pocillos de corte, reemplace el PBS con tampón de bloqueo/permeabilización (Tabla 1) e incube en RT durante 4 - 6 h.
2. Diluye el anticuerpo policlonal de conejillo de indias contra el transportador vesicular de glutamato 1 (vGlut1) en una dilución de 1:2,000 en tampón de bloqueo/permeabilización.
   NOTA: vGlut1 es un marcador para la visualización terminal excitatoria presináptica. Para la identificación de la sinapsis excitatoria postsináptica, se utiliza un anticuerpo policlonal contra la densidad postsináptica-95 (PSD-95) y se diluye 1:500 en la misma solución. Utilice un volumen mínimo de 300 μL en cada pocillo. Para identificar la ubicación anatómica del hipocampo, utilice un anticuerpo que también pueda identificar la estructura neuronal, como la proteína 2 asociada a los microtúbulos (MAP2) o la tubulina. Determinar las concentraciones correctas de todos los anticuerpos primarios para los marcadores sinápticos de elección (pre y postsinápticos) y diluir en un nuevo tampón bloqueante/permeabilizante.
3. Incubar las rodajas en la solución primaria de anticuerpos durante la noche (o durante 1 - 2 días) a 4 °C. Utilice una plataforma de agitación con movimientos vigorosos.
4. Lava las rodajas tres veces en PBS (10 min cada una).
5. Diluye los anticuerpos secundarios apropiados 1:500 en el tampón de bloqueo. Por ejemplo, cuando se usa el anticuerpo vGlut1 para conejillos de indias, aplique un anticuerpo secundario que reconozca el componente de conejillo de indias (por ejemplo, anticonejillo de indias de burro) conjugado con un fluoróforo específico. Cuando se utilice el anticuerpo PSD-95 contra conejos, aplique un anticuerpo secundario que reconozca el componente contra conejos (por ejemplo, anti-conejo burro) conjugado con un fluoróforo específico diferente.
6. Incube las rodajas en esta solución durante 2 - 3 h en RT. Asegúrese de que las rodajas estén protegidas de la luz, ya que los anticuerpos secundarios son sensibles a la luz.
7. Lava las rodajas tres veces en PBS (10 min cada una).
8. Retire cuidadosamente las rodajas de la placa de 24 pocillos con un pincel y colóquelas uniformemente en portaobjetos de vidrio preetiquetados. Agregue una gota de medio de montaje encima de cada rebanada y luego coloque suavemente un cubreobjetos de vidrio encima de las rebanadas. Evite la formación de burbujas de aire. Tenga cuidado de utilizar suficiente medio de montaje (300-400 μL), ya que una cantidad insuficiente puede provocar rodajas secas.
9. Dejar secar durante un mínimo de 1 - 2 días a RT y mantener las diapositivas protegidas de la luz.
10. Guarde las diapositivas a 4 °C a corto plazo, pero para almacenamiento a largo plazo, manténgalas a -20 °C.

3. Adquisición y análisis

1. de imágenes confocalImaging using confocal laser scanning microscop.
   1. Identifique la región del hipocampo que se va a visualizar (p. ej., el cornu ammonis 1 y 3 (CA1, CA3) o el giro dentado (DG)) mediante un objetivo de 10x o 20x.
   2. Cambie a un objetivo de inmersión en aceite de 40x o 63x para asegurarse de que la anatomía del corte esté intacta mediante la identificación de neuritas continuas y estructura organizada. Utilice un marcador neuronal, como MAP2, como referencia (Figura 1A).
   3. Posteriormente, cambie a un objetivo de inmersión en aceite de 60x (apertura numérica [NA] = ~1.3 - 1.4) y ajuste la configuración de cada canal para obtener una señal y un contraste óptimos. Utilice una opción de contraste alto/bajo para establecer la intensidad de cada láser y evitar la saturación de los píxeles.
      NOTA: Estos ajustes dependerán del microscopio utilizado, pero consulte la Tabla de Materiales para conocer los ajustes de potencia del láser. Para obtener los mejores resultados, utilice una resolución de 1024 x 1024 píxeles. Los ajustes deben permanecer constantes a lo largo de las diferentes condiciones del mismo experimento. Se puede aplicar un zoom adicional si es necesario.
   4. Evalúe la profundidad donde la tinción es uniforme y adquiera pilas de imágenes de al menos 8 planos equidistantes (250 nm). A continuación, tome 3 pilas de imágenes representativas adyacentes de la misma área de interés por segmento.
      NOTA: La profundidad puede variar de un corte a otro, pero siempre debe estar aproximadamente a 2 - 5 μm de la superficie del corte.
   5. Repita la adquisición en al menos 3 rebanadas por condición y de 6 a 8 animales por grupo de tratamiento.

Tabla 1: Tampones utilizados para la tinción inmunofluorescente.

KH₂PO₄

Blocking/permeabilizing Buffer	Concentration	Notes
Donkey serum	10%
Triton-X	0.50%
PBS	1x
10x PBS		pH a 7.4
NaCl	1.37 M
KCl	27 mM
NaH2PO4	100 mM
18 mM		4% PFA/4% Sacarosa		pH a 7.4
PBS	1x	Dilute from 10x
PFA	1.33 M
Sacarosa	117 mM

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Results

Tabla 1: Tampones utilizados para la tinción inmunofluorescente.

Blocking/permeabilizing Buffer

Materials