Este video muestra un método para visualizar marcadores sinápticos en cortes de cerebro del hipocampo utilizando el análisis de inmunofluorescencia confocal. Los cortes se inmunotiñen con anticuerpos primarios dirigidos a marcadores presinápticos y postsinápticos, seguidos de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos. A continuación, los marcadores marcados se visualizan mediante microscopía confocal para evaluar la arquitectura sináptica a través de su colocalización.
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Artículo de método
Análisis microscópico de sinapsis en cortes de hipocampo de ratón mediante inmunofluorescencia
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28 de abril de 2025
En este artículo
Resumen
Protocolo
Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Preparación de corte de hipocampo agudo
Retire el cerebro del ratón lo más rápido posible, utilizando una espátula y unas tijeras afiladas para cortar el cráneo, y colóquelo en líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF, ~100 mL) congelado y oxigenado (95% O2, 5% CO2....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Tabla 1: Tampones utilizados para la tinción inmunofluorescente.
| Blocking/permeabilizing Buffer |
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Vibratome | Leica VT1000S | ||
| Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
| Anticuerpo primario | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
| Primary anticuerpo | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
| Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
| Anticuerpo secundario | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
| Montaje medio | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
| Microscopio confocal | Olympus | NA | FV1000 microscopio confocal con un objetivo de aceite de apertura numérica (NA) de 60x 1.35. Para vGlut1, utilice un láser 488 con una potencia porcentual del 14%. Para PSD-95 utilice un láser 559 con una potencia porcentual del 20%. |
| Software de análisis | PerkinElmer | NA | Volocity |
| Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
| Super Glue | Loctite | 1446875 | |
| 95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cilindro |
| 24 pocillos | Corning | 3524 | |
| Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
| Petri Dish | Corning | 430167 | |
| iDkk1 mice | N/ | A N/A | Los ratones se obtuvieron cruzando ratones transgénicos tetO Dkk1 con ratones transgénicos CaMKIIα rtTA2. Los ratones transgénicos TetO Dkk1 y CaMKIIα rtTA2 se cruzaron en un estado heterocigótico. Ambas líneas de ratones se criaron con un fondo C57BL/6J. Se utilizaron como controles un solo transgénico y un compañero de camada WT. |
| Reactivos para soluciones: | |||
| NaCl | Sigma | V800372 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | 223506 | |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
| Ácido quinurénico | Sigma | K3375 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Ácido pirúvico | Sigma | 107360 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| D-Glucose | Sigma | G5767 | |
| Sacarosa | Sigma | S8501 | |
| Triton-X | Sigma | T8787 | |
| Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
| PFA | Sigma | P6148 |
