1. Preparación de rebanadas organotípicas
NOTA: Esta receta utiliza dos cachorros de ratón en el día postnatal 7-9 (p7-9), produciendo 24 rebanadas organotípicas divididas en dos platos de cultivo de seis pocillos. A menos que se indique lo contrario, todos los procedimientos deben realizarse en una capucha estéril y se deben usar guantes de nitrilo o látex. Solo se deben utilizar ingredientes de grado de cultivo celular.
- Se utilizaron frascos de autoclave, herramientas de disección (1 tijera grande, 1 tijera pequeña, 1 espátula plana grande, 1 espátula pequeña redondeada y afilada y 1 pinzas; consulte la lista de materiales para obtener más detalles), pipetas de vidrio, puntas de pipeta y toallitas de papel tisú para la preparación de la rebanada.
- Como la mitad de las pipetas de vidrio deben usarse con la abertura grande, rompa el extremo estrecho.
- Marca con un rotulador de diamante (si está disponible) alrededor de la pipeta justo debajo del punto donde el vidrio comienza a estrecharse. A continuación, coloque el extremo puntiagudo de la pipeta en un guante de nitrilo o similar. Rompa con cuidado la punta doblando la pipeta mientras la empuja contra un banco de trabajo.
- Luego, roma el extremo roto frotándolo sobre un trozo de papel de lija o derrítelo ligeramente en un mechero Bunsen. Las pipetas rotas se utilizan para transferir trozos de cerebro cortados, con el extremo roto convertido en el bulbo de goma y el extremo abierto grande tocando la solución o las rodajas.
NOTA: Esto no se hace en una campana estéril y se puede hacer con varios días de anticipación.
- Preparar platos de cultura.
NOTA: Esto se puede hacer el día antes de cortar o al menos 2 horas antes de cortar.- Esterilizar membranas de politetrafluoroetileno (PTFE) ("confeti"). Use dos pinzas estériles para quitar un solo confeti de las piezas de plástico azul circundantes. Luego, esterilice sumergiendo dos veces en una placa de Petri que contenga un 96% de etanol (EtOH). Luego, coloca el confeti en una placa de Petri grande y estéril para que se seque.
NOTA: El confeti son membranas hidrofílicas de PTFE similares a las membranas de los insertos de cultivo. El uso de confeti ayuda a la obtención de imágenes en vivo porque las rodajas individuales se pueden transferir fácilmente del inserto a la configuración del microscopio levantando el confeti con pinzas (ver 4.8. para más detalles). Alternativamente, las rodajas de cerebro se pueden cultivar sin el confeti (en el que las rodajas se unirán directamente a la membrana del inserto de cultivo). En este caso, el inserto de membrana debe cortarse con un bisturí para transferir la rebanada al baño del microscopio. - Añade 1 mL de medio de cultivo a cada pocillo de los platos de cultivo de seis pocillos.
- Coloque un inserto de cultivo en cada pocillo utilizando pinzas estériles. Evite las burbujas de aire entre el inserto y el medio de cultivo.
NOTA: Para ahorrar dinero y proteger el medio ambiente, es posible reutilizar las inserciones de cultivo. Esto se puede hacer mediante un enjuague exhaustivo en agua destilada (dH2O) seguido de una incubación en EtOH al 70% durante un mínimo de 24 horas hasta su reutilización. Cuando se prepare para un nuevo cultivo, seque los insertos en una placa de cultivo celular bajo luz ultravioleta (UV) durante 15-30 minutos. - Coloca dos confeti (esterilizado y seco) en cada uno de los insertos de cultivo. Coloque el confeti hacia los bordes de los insertos para obtener una superposición mínima.
- Coloque las placas en la incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2.
- Medio de disección en frío de burbujas con gas de bioóxido (95% O2/5%CO2). Para mantener la solución estéril, conecte el tubo del cilindro de gas a un filtro de jeringa estéril (tamaño de poro de 0,22 μm).
- Acople el otro extremo del filtro de jeringa a un tubo estéril conectado a una pipeta de vidrio estéril. Coloque la pipeta de vidrio en la solución, cúbrala con parafilm y encienda el gas. Mantenga el medio de disección en hielo.
- Prepara el área de disección/corte.
NOTA: Idealmente, este procedimiento debe realizarse en una capucha estéril. Si esto no es posible, el vibratomo se puede dejar en un banco de trabajo. En este caso, se recomienda utilizar una redecilla para el cabello y una mascarilla facial.- Con una cuchilla de afeitar de un solo filo, corta una pieza rectangular (aproximadamente 2 cm x 0,5 cm) de gel de agarosa y pégala en la platina del vibratomo de modo que el lado largo quede orientado hacia la hoja del vibratomo.
- Limpie todas las superficies y las partes del vibratomo con 70% de EtOH y limpie con toallitas de papel tisú esterilizadas en autoclave.
NOTA: Es importante que todas las piezas que estarán en contacto con el tejido cerebral estén completamente secas ya que el EtOH puede dañar las células. - Coloque una cuchilla de afeitar estéril en el vibratomo y realice una verificación de vibración para ver si el vibratome tiene esta función.
- Coloque herramientas de disección esterilizadas en autoclave, toallitas de papel tisú esterilizadas en autoclave, cuatro placas de Petri pequeñas, un bisturí de borde redondo, dos pipetas de vidrio con bulbos de goma, dos pipetas de vidrio abiertas (ver pt. 1.1) y superpegamento (rociado con EtOH) en el capó.
- Vierta el medio de disección burbujeado en el bote de vibratomo y en las cuatro pequeñas placas de Petri.
NOTA: Este paso solo debe realizarse inmediatamente antes de la disección, ya que el medio a partir de este punto no burbujea ni se mantiene en hielo.
- Disecciona y monta cerebros.
NOTA: Para obtener rebanadas saludables, este paso debe realizarse de forma rápida y precisa. Se necesita algo de práctica.- Sacrificar al animal #1 por dislocación del cuello o según las pautas locales y luego decapitarlo con las tijeras grandes.
- Con unas tijeras pequeñas y afiladas, retira rápidamente la piel haciendo una incisión sagital desde el cuello hasta la nariz y tira de ella a un lado para revelar el cráneo.
- Corte a lo largo de la sutura sagital, seguido de incisiones laterales sobre la parte interior de los huesos frontales y la sutura lamboides (el borde entre el cerebro y el cerebelo).
- Use fórceps para abrir el cráneo a cada lado. Los nervios craneales se separan del cerebro insertando una espátula redondeada y afilada debajo del lado ventral del cerebro y moviendo suavemente la espátula lateralmente.
- Use una cuchilla de afeitar de un solo filo para hacer un corte coronal rostral al cerebelo.
NOTA: Este corte determinará el ángulo en el que se cortan las rebanadas. Por lo tanto, debe hacerse en ángulo recto. - Saca el cerebro del cráneo y colócalo en una pequeña placa de Petri que contiene un medio de disección.
- Repita los pasos 1.6.1. - 1.6.4. para el animal #2 y coloque este cerebro en una segunda placa de Petri.
NOTA: Los animales no son estériles. Realice la disección en un lado de la capucha y luego muévase al otro lado limpio una vez que los cerebros se hayan extraído del cráneo. - Cambia guantes.
- Adjunta el cerebro a la etapa de vibratome: añade una fina capa de superpegamento a la etapa justo delante del gel de agarosa montado. Sostenga el cerebro # 1 con una espátula grande y plana con el lado recién cortado (caudal) tocando la espátula y el lado ventral mirando (y estando lo más cerca posible de) el gel de agarosa.
- Luego, coloca suavemente el cerebro sobre el pegamento empujándolo fuera de la espátula con un juego de pinzas. Asegúrate de dejar suficiente espacio para el cerebro #2.
NOTA: Es importante que los cerebros estén bien adheridos al escenario pero sin exceso de pegamento, ya que esto puede obstruir el corte.
- Inmediatamente después de montar el cerebro #1, use la espátula grande para agregar algunas gotas de medio de disección en la parte superior del cerebro. Esto mantendrá el cerebro húmedo, endurecerá el pegamento y evitará que se pegue a los lados del cerebro.
- Repita los pasos 1.6.7 y 1.6.8. para el cerebro #2.
- Coloca el escenario en el bote de vibratome.
- Corta cortes coronales de 230 μm de grosor con una amplitud de 1 - 1,5 mm, una frecuencia de 85 Hz y una velocidad de 0,2 mm/s. Recoge rodajas aproximadamente entre 1,4 mm rostral y 2,1 mm caudal a Bregma.
- Recoge cortes después de que cada corte haya sido cortado usando pipetas de vidrio abiertas (pt. 1.1). Transfiera las rodajas a una placa de Petri que contenga un medio de disección. Usa un bisturí redondeado para cortar las rodajas en dos trozos, dividiendo los dos hemisferios.
- Cuando todas las rebanadas estén cortadas, coloque las rebanadas en los platos de cultivo.
- Saca la placa de cultivo (una a la vez) de la incubadora.
- Usando las pipetas de vidrio abiertas, transfiera cuidadosamente una rebanada a cada uno de los confeti.
NOTA: Las rodajas deben quedar planas en el centro del confeti. Esto requiere cierta habilidad. Sin embargo, si algunas rodajas no son perfectas, es mejor dejarlas que dedicar tiempo a tratar de moverlas, ya que es importante colocar todas las rodajas en la incubadora lo más rápido posible. - Utilice una pipeta de vidrio (extremo puntiagudo) para eliminar suavemente el exceso de medio sin tocar la rebanada.
NOTA: Las rodajas no deben sumergirse en líquido durante la incubación. Por lo tanto, el exceso de medio debe aspirarse de manera que las rodajas queden expuestas al aire (una película delgada de medio aún cubrirá las rodajas). Las rodajas que permanecen sumergidas en el líquido generalmente no serán saludables o morirán (4 y nuestras observaciones). - Vuelve a meter el plato en la incubadora una vez que todo el confeti tenga una rebanada.
- Repita los pasos 1.7.8. - 1.8.4. para el plato #2.
- Cambia el medio de cultivo.
NOTA: Esto debe hacerse el día después del corte (día 1 in vitro, DIV1) y luego cada 2-3 días.- Precalienta el medio de cultivo en un baño de agua o en la incubadora.
- En una campana estéril, use succión al vacío o una pipeta regular con una punta estéril para aspirar el medio de cultivo de cada pocillo. Esto se hace inclinando suavemente la placa (unos 30 grados) y colocando la punta de la pipeta en el borde del inserto de cultivo.
- Retira aproximadamente 800 μL de cada pocillo (dejando solo el medio suficiente para mantener el fondo del inserto cubierto de medio). A continuación, con una pipeta limpia, añada 800 μL del medio precalentado a cada pocillo. A continuación, vuelva a colocar las placas en la incubadora de cultivos celulares.
2. Viral Transduction
- Compre o cree Virus Adeno-Asociados (AAVs) con un plásmido de interés.
NOTA: Este protocolo describe el uso del serotipo 2/8 de AAV (AAV 2/8) portador de dsred o GFP dirigido mitocondrial como gen reportero bajo el control transcripcional del promotor de proteína básica de mielina12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred o AAV2/8 MBP_mito_GFP) para visualizar mitocondrias de oligodendrocitos. AAV 2/8 portador de GFP o tdtomato como gen reportero impulsado por el promotor general de CAG (AAV 2/8 CAG_GFP o AAV 2/8 CAG_tdtomato) se utiliza para visualizar el citoplasma de oligodendrocitos. Por lo tanto, la combinación de AAV2/8 MBP_mito_dsred con AAV 2/8 CAG_GFP da mitocondrias rojas y citoplasma verde en oligodendrocitos, mientras que la combinación de AAV2/8 MBP_mito_GFP y AAV 2/8 CAG_tdtomato da mitocondrias verdes y citoplasma rojo. Los constructos se describen con más detalle en otro lugar13. - En el día 7 in vitro (DIV7), se transducen oligodendrocitos con los AAVs.
PRECAUCIÓN: Siga las normas de seguridad cuando trabaje con AAV. Asegúrese de tener la capacitación adecuada y la aprobación del nivel de bioseguridad requerida. Todos los puntos siguientes deben llevarse a cabo en una cabina de bioseguridad de Clase II utilizando guantes y bata de laboratorio. Aquí se describe la aplicación de AAV en el área de la corteza de los cortes, ya que esta es el área que muestra la mejor recuperación.- Diluye el AAV en un medio de cultivo precalentado (37 °C). Se recomiendan diluciones de alrededor de 2 × 109 copias del genoma/mL (GC/mL) para obtener una transducción dispersa de oligodendrocitos, lo que permite obtener imágenes de células individuales dentro del corte. Sin embargo, se debe realizar un piloto utilizando diferentes títulos para asegurar una densidad de oligodendrocitos transducidos que sea adecuada para los experimentos específicos. Si se utilizan dos AAV diferentes, deben mezclarse en la misma solución y agregarse a la rebanada simultáneamente.
- Añade alrededor de 1,3 μL de AAV diluido a cada rebanada. Asegúrese de que el exterior de la punta de la pipeta esté seco. Pipetear 1,3 μL de AAV diluido y sujetar la pipeta por encima de la corteza lo más cerca posible sin tocar el corte con la punta de la pipeta (a una distancia aproximada de 1 mm).
- Luego empuje lentamente la solución fuera de la pipeta. Cuando la solución toque la rebanada, mueva la punta de la pipeta sobre la corteza para esparcir la solución por toda el área de la corteza.
NOTA: Este procedimiento debe realizarse lo más rápido posible para evitar mantener las rebanadas fuera del capó por más tiempo del necesario. Haga esto en un plato a la vez y vuelva a colocar el primer plato en la incubadora antes de comenzar con el plato # 2. Para obtener una distribución satisfactoria de AAV sin dañar el tejido se requiere algo de práctica y una mano firme.
- Si se dispone de un microscopio de fluorescencia vertical en el laboratorio celular, se puede comprobar la expresión de proteínas durante el tiempo de cultivo colocando la placa bajo el microscopio.
NOTA: El plato no debe mantenerse fuera de la incubadora durante más de 2 a 5 minutos.
3. Time-lapse Imaging
NOTA: Las imágenes se pueden realizar siempre que los niveles de expresión de los marcadores fluorescentes sean suficientes, y los cortes se vean saludables (generalmente DIV11-14).
- Asegúrese de que el microscopio, la perfusión y el calentamiento estén configurados correctamente para que la solución de imagen burbujeada se caliente y pueda entrar y salir del baño.
NOTA: Existen varias soluciones para las cámaras de baño. Aquí se presenta una versión simple.- Hacer entradas y salidas de la bañera con agujas de jeringa desafiladas (dobladas a ~45°) que se unen a los lados de la bañera mediante blu-tack/fun tack.
- Asegúrese de que el tubo pase de una botella de solución de imagen continuamente burbujeada a través de la bomba peristáltica, a través del tubo de calentamiento de la unidad de calentamiento, y luego a la aguja de la jeringa de entrada en el baño.
- Conecte otro tubo a la salida de la aguja de la jeringa. Luego, este tubo pasa a través de la bomba peristáltica y regresa al frasco de solución de diagnóstico por imágenes (o a un frasco de desechos).
- Solución de imagen de burbujas con gas bioóxido.
NOTA: Esto debe iniciarse al menos 15 minutos antes de la creación de imágenes y continuar durante todo el experimento. - Encienda la bomba peristáltica y el calentador y haga pasar la solución por el baño para obtener la temperatura óptima del baño (37 ± 0.5 °C). Asegúrese de que el sensor del termómetro conectado a la unidad de temperatura esté sumergido en la solución del baño.
- Enciende el microscopio, la lámpara de fluorescencia y los láseres apropiados.
- Configura una ruta de luz adecuada para la muestra.
NOTA: Esto variará dependiendo de la configuración del microscopio y la sonda. Se requieren conocimientos generales sobre cómo usar el microscopio confocal y no se tratarán aquí. - Utilice un objetivo de inmersión en agua con el aumento y la apertura numérica adecuados (n.a.). Utilizamos un objetivo apocromático de plan de inmersión en agua de 40x (n.a. 1.0).
- Abra el agujero de alfiler para lograr una sección óptica de aproximadamente 2 - 2.5 μm para el video de lapso de tiempo. Esto reduce la aparición de mitocondrias que se desenfocan durante el lapso de tiempo.
- Transfiere la rebanada organotípica al baño:
- Añade una gota de solución de imagen o medio de cultivo a una pequeña placa de Petri de plástico.
- En una campana estéril, use pinzas estériles para transferir un corte organotípico del inserto de la membrana a la gota. Las pinzas solo deben tocar el confeti y no la rebanada.
- Coloca la tapa en la placa de Petri.
- Vuelva a colocar inmediatamente el plato de cultivo que contiene el resto de las rebanadas en la incubadora.
- Lleva al microscopio una placa de Petri que contiene la rebanada.
- Apague la bomba peristáltica mientras transfiere la rebanada al baño del microscopio. Primero, use pinzas para levantar el confeti con una rebanada de la placa de Petri hasta la parte superior del baño (el confeti flotará). A continuación, coloca las dos puntas de las pinzas a cada lado del confeti de forma que toquen el confeti sin tocar la rebanada, y empuja el confeti a través de la solución hasta el fondo de la bañera. Centra el confeti en el centro del baño.
- Use pinzas para colocar el ancla de sujeción (arpa) encima del confeti sin tocar la rebanada.
NOTA: Un arpa es un ancla de platino en forma de herradura que se utiliza para evitar que la rebanada flote o flote en el baño. Para los cortes agudos, las cuerdas delgadas corren de un lado del arpa al otro (asemejándose a un arpa musical). Para las rebanadas organotípicas, el arpa debe ser sin cuerdas y ajustarse al tamaño del confeti de tal manera que pueda colocarse encima del confeti sin tocar la rebanada. - Vuelva a encender la bomba peristáltica.
- Baja el objetivo hasta la muestra.
- Seleccione la celda y la región a la imagen.
NOTA: Evite la exposición excesiva de las células a la luz láser, ya que esto puede causar toxicidad celular (consulte los consejos en los puntos a continuación).- Utilice los oculares y la lámpara fluorescente para encontrar un oligodendrocito de aspecto saludable con la expresión correcta. Por lo general, los oligodendrocitos que tienen una fuerte sobreexpresión de proteína fluorescente parecen poco saludables. Los oligodendrocitos no saludables tendrán procesos con una apariencia borrosa y las mitocondrias aparecerán fragmentadas. En los oligodendrocitos sanos, el soma y los procesos parecen suaves, y las mitocondrias tienen varias longitudes (aunque suelen ser mucho más cortas que en las neuronas y los astrocitos).
- Coloca la celda de interés en el centro del campo de visión.
- Utilice la función "live" en el software (para microscopios Leica y Zeiss) para identificar la célula en la pantalla y elija un área de interés, por ejemplo, una parte de la célula que contenga varios procesos primarios o vainas de mielina o un solo proceso o vaina de mielina.
NOTA: Para poder visualizar la mayor cantidad posible de procesos/vainas, elija áreas que contengan procesos que queden relativamente planos en la dirección x-y. - Amplía el campo de interés (normalmente produce una imagen con un tamaño de píxel de 0.14 - 0.30 μm).
- Usando la herramienta "regiones", dibuja un rectángulo alrededor del área y elige la opción de escanear solo la región seleccionada. El tiempo de escaneo y, por lo tanto, la exposición al láser, se reduce escaneando solo la región seleccionada.
NOTA: Las regiones rectangulares horizontales se escanearán más rápido que las regiones verticales debido al menor número de líneas escaneadas necesarias. Si se escanea una región rectangular vertical, el tiempo de escaneo se puede reducir girando el campo de escaneo 90 grados (usando la herramienta de rotación).
- Ajusta la potencia y la ganancia del láser para obtener una buena vista de las mitocondrias.
NOTA: Utilice la potencia láser mínima necesaria. Si es posible, aumente la ganancia en lugar de aumentar la potencia del láser. Además de causar toxicidad celular, una potencia láser demasiado alta blanqueará los objetos fotografiados con el tiempo, lo que requerirá un aumento adicional de la potencia o ganancia del láser durante el escaneo. La potencia y la ganancia del láser requeridas dependerán del nivel de expresión y del microscopio. Con un microscopio confocal LSM700, utilizamos un láser de 555 nm a una potencia de 20-40 μW para obtener imágenes de dsred o tdtomato, y un láser de 488 nm se utiliza a 20 - 30 μW para obtener imágenes de GFP (potencia láser medida en la apertura posterior del objetivo). La ganancia se establece alta para imágenes en vivo, generalmente en el rango de 700 a 800 para GFP y de 850 a 980 para dsred y tdtomato. La alta ganancia puede causar más ruido de fondo, que se elimina aumentando el desplazamiento digital (los valores de desplazamiento suelen estar entre 0 y 15). En nuestra experiencia, el uso de MBP_mito_GFP proporciona una mejor relación señal-ruido que MBP_mito_dsred. - Seleccione la velocidad de escaneo.
NOTA: Minimice el tiempo de escaneo utilizando una velocidad de escaneo rápida y dibujando una pequeña región de escaneo (consulte el punto 4.10.5 a continuación). También es posible ahorrar tiempo de escaneo realizando un escaneo bidireccional. Sin embargo, esto no se recomienda debido a una peor calidad de imagen. - Establezca la frecuencia y la duración de la grabación de lapso de tiempo, por ejemplo, capture imágenes cada 2 segundos durante un total de 20 minutos para imágenes mitocondriales en oligodendrocitos.
NOTA: La frecuencia y la duración deben establecerse de acuerdo con la movilidad de los objetos de interés. Una frecuencia más alta expondrá el espécimen a más luz láser, pero los objetos que se mueven más rápido también requieren una duración total más corta de videos de lapso de tiempo (por ejemplo, las mitocondrias en las neuronas, que se mueven con más frecuencia y a una velocidad mucho mayor que las mitocondrias en los oligodendrocitos, generalmente se obtienen imágenes cada segundo durante un total de 2 minutos16). - Inicia la grabación time-lapse.
NOTA: Las mitocondrias pueden desenfocarse y/o salirse de la región de la imagen durante la grabación. Para minimizar las vibraciones y el movimiento, ajuste las entradas y salidas del baño y reduzca la velocidad de la bomba si es necesario. Por lo general, aún ocurren pequeños cambios en el enfoque. Por lo tanto, se requiere un monitoreo continuo de la pantalla durante la imagen, con pequeños ajustes del enfoque durante la grabación.
Captura una pila z de toda la celda para la futura identificación de la celda y el proceso de la imagen.
NOTA: Para una mejor resolución, el agujero de alfiler debe restablecerse a 1 unidad aireada para la pila z.