Este video demuestra el uso de la microscopía de dos fotones para estudiar la atracción de los procesos microgliales hacia un compuesto inyectado en cortes de cerebro. Proporciona una descripción general de la preparación de cortes de cerebro de ratón, la inyección de un compuesto de prueba quimioatrayente y la obtención de imágenes de microglía marcadas con fluorescencia para visualizar sus respuestas.
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Artículo de método
Microscopía de dos fotones para estudiar la atracción del proceso microglial hacia un compuesto en un corte de cerebro de ratón
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28 de abril de 2025
En este artículo
Resumen
Protocolo
Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión de ética animal apropiado.
1. Microscopía de dos fotones
- Parameters setting<ol style='margin-bottom:0;margin-top:0;padding-inline-start:48px;'>
- Encienda el sistema multifotónico (detectores híbridos, láser, escáner, modulador electroóptico, microscopio).
- Ajuste el láser a 920 nm, verifique que el láser esté bloqueado en modo y configure la potencia entre 5% y 15% y la ganancia en 10%. Esto corresponde a una potencia de 3 - 5 mW bajo el objetivo. Asegúrese de que los detectores no desactivados estén activados y de que se hayan instalado los filtros de emisión y excitación adecuados.
- Establezca los parámetros del software de imagen en los siguientes valores: para el tamaño del fotograma, 1024 x 1024 píxeles correspondientes a un área de 295,07 x 295,07 μm; para el zoom, 2. Si la señal es muy ruidosa, aplique un promedio de línea de 2. Para la dinámica de píxeles, configure el software de imagen a 12 bits o más.
NOTA: Las imágenes con un valor de bits más alto permiten a los investigadores distinguir diferencias más pequeñas en la intensidad de fluorescencia que las imágenes con un valor de bits más bajo: un cambio de un valor de gris en una imagen de 8 bits correspondería a un cambio de 16 valores de gris en una imagen de 12 bits y de 256 valores de gris en una imagen de 16 bits. Por lo tanto, las imágenes de bits más altos son más apropiadas para el análisis cuantitativo, pero a medida que su tamaño aumenta con la profundidad de bits, la capacidad de almacenamiento y la potencia de cálculo pueden llegar a ser limitantes. - Seleccione el modo de escaneo XYZT con un intervalo Z de 2 μm y un intervalo T de 2 min.
NOTA: La resolución x, y y z está determinada por el teorema de muestreo de Nyquist. Un tamaño de paso Z de alrededor de 0,8 sería óptimo para resolver procesos de microglía (con un diámetro de <1 μm), pero la resolución óptica de la microscopía multifotónica es limitante (a 920 nm con un objetivo de 0,95 NA, la resolución axial es de alrededor de 1 μm). Además de esa barrera física, en un experimento de imágenes en vivo, la sensibilidad o la relación señal-ruido, la resolución, la velocidad y el tiempo total de observación son importantes. Teniendo en cuenta todos estos parámetros, se seleccionó un paso z de 2 μm, un tamaño de imagen de 1024 x 1024 píxeles y una adquisición de alta velocidad utilizando un escáner resonante acoplado a detectores HyD (se tarda unos 15 s en adquirir 50 planos z). La frecuencia de las adquisiciones es de una serie XYZT cada 2 min, y la duración total es de 30 min. Si la configuración no es lo suficientemente rápida o sensible, es posible reducir la resolución lateral (hasta 512 x 512) o el número de cortes z (tomando imágenes exclusivamente en la profundidad z que exhibe la fluorescencia más fuerte [i.e., las cortes z más profundas donde la fluorescencia es tenue]), o para disminuir la velocidad del escáner. La resolución axial también puede disminuirse aumentando el paso z hasta 3 μm, pero como esto puede afectar a la cuantificación, todos los experimentos que se comparen deben realizarse con el mismo paso z.
NOTA: Es posible realizar experimentos similares en cortes de ratones CX3CR1creER-YFP, una línea de ratón utilizada para inducir la deleción genética solo en la microglía y en la que la microglía expresa constitutivamente la proteína fluorescente amarilla (YFP). Sin embargo, el nivel de expresión de YFP es muy bajo en comparación con la proteína fluorescente verde (GFP) en CX3CR1GFP/+ ratones; Por lo tanto, la obtención de imágenes es posible, pero desafiante y requiere la optimización de los parámetros de adquisición. Se recomienda ajustarlos de la siguiente manera. - Ajuste el láser a 970 nm (que se adapta mejor a la excitación YFP que 920 nm), la potencia al 50% y la ganancia al 50%, lo que corresponde a una potencia del láser bajo el objetivo de 5 - 6 mW.
- Establezca un promedio de línea de 4 (o más) para mejorar la relación señal-ruido.
- Conecte la bomba peristáltica a la cámara de grabación, 30 min antes de comenzar la grabación. Después de limpiar todo el sistema de perfusión con 50 mL de agua ultrapura, iniciar la perfusión de la cámara de registro con aCSF (50 mL) contenido en un vaso de precipitados de vidrio bajo carbogenación constante. A lo largo del experimento, mantenga el aCSF circulante a 32 °C con un microcalentador en línea o un calentador Peltier.
NOTA: Una cámara de perfusión específica con perfusión superior e inferior está diseñada para optimizar la oxigenación en ambos lados de la loncha. La cámara de perfusión se compone de dos partes perfectamente ajustadas, con una malla de poliamida estirada entre ellas (Figure 1A,B). En comparación con otros tipos de cámaras, en las que la loncha se coloca directamente sobre un cubreobjetos de vidrio, esta cámara reduce la muerte neuronal en la parte inferior de la loncha, mejora la viabilidad y reduce los movimientos de la loncha inducidos por su hinchazón. - Con una pipeta de transferencia desechable de boca ancha, transfiera el trozo de cerebro que se va a obtener a la imagen al vaso de precipitados aCSF para eliminar el papel de la lente, deje que se hunda (como prueba de que no hay burbujas de aire) y transfiéralo a la cámara de registro (perfusión).
- Coloque un soporte de rebanada (una horquilla hecha de platino con las dos ramas unidas por hilos de nailon paralelos) en la rebanada para minimizar el movimiento de la rebanada debido al flujo de perfusión.
- Utilice la iluminación de campo claro para apuntar a la región de interés del cerebro (tiempo de exposición: 50 a 80 ms) utilizando un objetivo de bajo aumento (5X o 10X). Cambie al objetivo de inmersión en agua de mayor aumento (25x con una lente de 0.35x) y ajuste la posición.
NOTA: Evite visualizar los campos cercanos a los hilos de nailon del soporte de la rebanada, ya que pueden bloquear la luz y deformar localmente la rebanada. Asegúrese de que el área de interés sea plana. Si es necesario, retire el soporte de rebanadas para volver a colocar la rebanada y/o el portarebanadas. - Utilice la iluminación de fluorescencia para localizar las células microgliales fluorescentes que se van a visualizar en el campo (tiempo de exposición: 250 - 500 ms).
NOTA: Este paso permite a los investigadores comprobar la presencia de células en la región de interés y su intensidad de fluorescencia, y controlar la cantidad de restos celulares. - Rellene la pipeta con 10 μL de aCSF con ATP, 5-HT o el fármaco de interés en su concentración final. Apunte la punta hacia abajo y agite suavemente la pipeta llena de fármaco para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la punta.
NOTA: Si la solución a inyectar tiende a formar burbujas, considere usar pipetas de borosilicato con un filamento interno. La fuga de ATP fuera de la pipeta puede atraer procesos microgliales incluso antes de la inyección (si esto ocurre, será visible en la etapa de análisis). Aunque esto debería ser moderado con la concentración de ATP utilizada (500 μmol·L-1), si se trata de un problema, considere la posibilidad de prellenar la micropipeta con 2 ml de aCSF antes de añadir la solución de ATP (u otro compuesto) en el paso 1.2.6. - Monte la pipeta llena en un soporte de pipeta, conectado con un tubo transparente a una jeringa de 5 ml, con un émbolo colocado en la posición de 5 ml. El propio soporte de pipeta está montado en un micromanipulador de tres ejes.
- Bajo iluminación de campo claro, utilice el micromanipulador para colocar la pipeta en el centro del campo. Para un centrado óptimo y reproducible, visualice y utilice las reglas de la imagen.
- Baje la pipeta suavemente hacia la loncha, controlando y ajustando el objetivo al mismo tiempo hasta que la punta de la pipeta toque ligeramente la superficie de la loncha. Detener el descenso de la pipeta tan pronto como sea visible que se ha tocado el corte permite que la punta de la pipeta penetre entre 80 y 100 μm de la superficie del corte (ver Figura 2B).
- Ajuste el láser (consulte los parámetros anteriores) y cambie el microscopio al modo multifotónico. Asegúrese de que la cámara esté protegida de cualquier fuente de luz (por ejemplo, la pantalla de una computadora). Encienda los detectores no desescaneados y ajuste la ganancia. Utilice una tabla de búsqueda (LUT) con un límite superior codificado por colores para evitar saturar los píxeles de la imagen.
- Determine el grosor del corte que se va a visualizar (es decir, las posiciones z superior e inferior donde se puede detectar la fluorescencia [generalmente entre 220 y 290 μm en total]).
NOTA: En la superficie de la loncha, hay una mayor densidad de procesos y posiblemente de microglía, a menudo con una morfología inusual, en comparación con el interior de la loncha. Esta acumulación será más llamativa con el tiempo (es decir., más visible en el último que en el primer corte de cerebro que se imagen). Por lo tanto, los planos z en los primeros ~30 μm no deben usarse para el análisis e incluso se pueden omitir para la adquisición. - Comience a grabar durante un total de 30 minutos (o más si lo desea) y después de una línea de base de 5 minutos, aplique localmente el compuesto que se va a probar (sin interrumpir la imagen). Para ello, presione lentamente el émbolo de la jeringa conectada a la micropipeta, desde la posición de 5 mL hasta la de 1 mL (en unos 5 s). La resistencia al presionar el émbolo debe sentirse de inmediato. De lo contrario, la punta podría estar rota.
NOTA: Para un experimentador entrenado, las inyecciones con este método son reproducibles, pero alternativamente a la manipulación manual de una jeringa, la pipeta podría vincularse a un sistema automatizado de expulsión de presión para permitir un mejor control del volumen administrado. La inyección crea una distorsión física del corte en el sitio de la inyección. Esta distorsión es visible a posteriori en las primeras dos o tres imágenes después de la inyección, pero no debe ser visible en la cuarta imagen (es decir, 8 minutos después de la inyección). Si persiste, considere la posibilidad de cambiar los parámetros de la preparación de la pipeta. - Al final de la adquisición (30 min), deseche la micropipeta y retire la loncha.
- Antes de empezar a crear una imagen de un nuevo corte, realice la película en 2D (sección 2.1) para comprobar que las microglías tienen una morfología normal y se están moviendo y, por lo tanto, que los cortes están sanos.
2. Análisis de la atracción de los procesos microgliales
- 2D projection and drift correction
- Abre el archivo (. LIF) con Fiji.
- Si es necesario, crea una subpila (Image/Stacks/Tools/Make Substack) con solo los planos z de interés. Por ejemplo, excluya los planos z correspondientes a la superficie del corte si se han adquirido pero no se van a utilizar para el análisis (consulte la NOTA después del paso 1.2.11) y los planos z más profundos sin fluorescencia. La pila final generalmente contiene de 90 a 110 rebanadas z (180 a 220 μm).
- Inicie el Z project function (Image/Stacks/Z Project") y seleccione el Max Intensity<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> tipo de proyección para hacer las proyecciones de la pila z adquiridas en cada momento punto.
- Inicie el MultiStackReg plugin (Plugin/Registration/MultiStackReg), seleccionando Action 1: Align y Transformation: Rigid Body corregir ligeras desviaciones que puedan haberse producido durante la adquisición. Guarde esta película 2D como un archivo nuevo (.tiff).
- Procesamiento de datos
- Abre este nuevo archivo con Icy.
- Dibuja un R1 región de interés (ROI) de 35 μm de diámetro, centrada en el lugar de la inyección (identificada especialmente por la sombra de la pipeta y la distorsión creada en el momento de la inyección).
- Utilice el complemento ROI intensity evolution y mida la intensidad media a lo largo de tiempo en R1.
- Guarde los resultados en un archivo .XLS.
- Cuantificación y representación de los resultados
- Para cuantificar la respuesta microglial a lo largo del tiempo, determine en cada punto de tiempo.
Luego, los resultados se pueden representar como una cinética de la respuesta microglial, o en un punto de tiempo específico (ver Figure 3).
- Para cuantificar la respuesta microglial a lo largo del tiempo, determine en cada punto de tiempo.
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Resultados
Figura 1: Detalles de la cámara de interfaz. (A) Esquema para la impresión 3D del portarebanadas. El diámetro exterior del soporte es de 7 cm. (B) Soporte de rebanadas de interfaz con la malla de nylon (flecha) que permite a los investigadores mantener las lonchas en la interfaz líquido-aire. (C...
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| × 25 0.95 NA water-immersion objective | |||
| 2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors | |||
| Antlia-3C Digital Peristaltic | |||
| Carbogen 5% dióxido de carbono/95% oxígeno | I1501L50R2A001 | ||
| Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser | |||
| Por ejemplo: 232-11 | |||
| Filtro de emisión SP680 | |||
| Cubo fluorescente que contiene un filtro de emisión 525/50 y un filtro dicroico 560 (para la recolección de fluorescencia) | |||
| Heating system< | |||
| Perfusion chamber< | |||
| Slice holder ("harp") | |||
| For slice stimulation | |||
| Adenosina 5′-trifosfato hidrato de sal disódica (ATP) | a preparar ex-temporáneamente: 1mg/ml (3mM) de solución madre preparada el día del experimento, mantenida a 4°C (unas pocas horas) y diluida justo antes de su uso | ||
| Fluorescein (opcional) | |||
| Micromanipulator | |||
| Micropipette holder< | |||
| Clorhidrato de serotonina | alícuotas de 50 mM de solución madre en H20 mantenida a -20 °C. Solución de 500 μM preparada el día del experimento. | ||
| Jeringa 5mL (sin aguja) | SS+05S1 | ||
| Transparent tubing | Fischer Scientific | ||
| For image analysis | |||
| Fiji | |||
| Icy | |||
| Mice | |||
| CX3CR1-GFP mices | machos o hembras, de P3 a 2 meses de edad; Hemos retrocruzado estos ratones en el fondo 129SV. | ||
| CX3CR1creER-YFP mice |
