Microscopía de dos fotones para estudiar la atracción del proceso microglial hacia un compuesto en un corte de cerebro de ratón

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión de ética animal apropiado.

1. Microscopía de dos fotones

1. Parameters setting<ol style='margin-bottom:0;margin-top:0;padding-inline-start:48px;'>
2. Encienda el sistema multifotónico (detectores híbridos, láser, escáner, modulador electroóptico, microscopio).
3. Ajuste el láser a 920 nm, verifique que el láser esté bloqueado en modo y configure la potencia entre 5% y 15% y la ganancia en 10%. Esto corresponde a una potencia de 3 - 5 mW bajo el objetivo. Asegúrese de que los detectores no desactivados estén activados y de que se hayan instalado los filtros de emisión y excitación adecuados.
4. Establezca los parámetros del software de imagen en los siguientes valores: para el tamaño del fotograma, 1024 x 1024 píxeles correspondientes a un área de 295,07 x 295,07 μm; para el zoom, 2. Si la señal es muy ruidosa, aplique un promedio de línea de 2. Para la dinámica de píxeles, configure el software de imagen a 12 bits o más.
   NOTA: Las imágenes con un valor de bits más alto permiten a los investigadores distinguir diferencias más pequeñas en la intensidad de fluorescencia que las imágenes con un valor de bits más bajo: un cambio de un valor de gris en una imagen de 8 bits correspondería a un cambio de 16 valores de gris en una imagen de 12 bits y de 256 valores de gris en una imagen de 16 bits. Por lo tanto, las imágenes de bits más altos son más apropiadas para el análisis cuantitativo, pero a medida que su tamaño aumenta con la profundidad de bits, la capacidad de almacenamiento y la potencia de cálculo pueden llegar a ser limitantes.
5. Seleccione el modo de escaneo XYZT con un intervalo Z de 2 μm y un intervalo T de 2 min.
   NOTA: La resolución x, y y z está determinada por el teorema de muestreo de Nyquist. Un tamaño de paso Z de alrededor de 0,8 sería óptimo para resolver procesos de microglía (con un diámetro de <1 μm), pero la resolución óptica de la microscopía multifotónica es limitante (a 920 nm con un objetivo de 0,95 NA, la resolución axial es de alrededor de 1 μm). Además de esa barrera física, en un experimento de imágenes en vivo, la sensibilidad o la relación señal-ruido, la resolución, la velocidad y el tiempo total de observación son importantes. Teniendo en cuenta todos estos parámetros, se seleccionó un paso z de 2 μm, un tamaño de imagen de 1024 x 1024 píxeles y una adquisición de alta velocidad utilizando un escáner resonante acoplado a detectores HyD (se tarda unos 15 s en adquirir 50 planos z). La frecuencia de las adquisiciones es de una serie XYZT cada 2 min, y la duración total es de 30 min. Si la configuración no es lo suficientemente rápida o sensible, es posible reducir la resolución lateral (hasta 512 x 512) o el número de cortes z (tomando imágenes exclusivamente en la profundidad z que exhibe la fluorescencia más fuerte [i.e., las cortes z más profundas donde la fluorescencia es tenue]), o para disminuir la velocidad del escáner. La resolución axial también puede disminuirse aumentando el paso z hasta 3 μm, pero como esto puede afectar a la cuantificación, todos los experimentos que se comparen deben realizarse con el mismo paso z.
   NOTA: Es posible realizar experimentos similares en cortes de ratones CX3CR1creER-YFP, una línea de ratón utilizada para inducir la deleción genética solo en la microglía y en la que la microglía expresa constitutivamente la proteína fluorescente amarilla (YFP). Sin embargo, el nivel de expresión de YFP es muy bajo en comparación con la proteína fluorescente verde (GFP) en CX3CR1^GFP/+ ratones; Por lo tanto, la obtención de imágenes es posible, pero desafiante y requiere la optimización de los parámetros de adquisición. Se recomienda ajustarlos de la siguiente manera.
6. Ajuste el láser a 970 nm (que se adapta mejor a la excitación YFP que 920 nm), la potencia al 50% y la ganancia al 50%, lo que corresponde a una potencia del láser bajo el objetivo de 5 - 6 mW.
7. Establezca un promedio de línea de 4 (o más) para mejorar la relación señal-ruido.

2. Análisis de la atracción de los procesos microgliales

1. 2D projection and drift correction
   1. Abre el archivo (. LIF) con Fiji.
   2. Si es necesario, crea una subpila (Image/Stacks/Tools/Make Substack) con solo los planos z de interés. Por ejemplo, excluya los planos z correspondientes a la superficie del corte si se han adquirido pero no se van a utilizar para el análisis (consulte la NOTA después del paso 1.2.11) y los planos z más profundos sin fluorescencia. La pila final generalmente contiene de 90 a 110 rebanadas z (180 a 220 μm).
   3. Inicie el Z project function (Image/Stacks/Z Project") y seleccione el Max Intensity<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> tipo de proyección para hacer las proyecciones de la pila z adquiridas en cada momento punto.
   4. Inicie el MultiStackReg plugin (Plugin/Registration/MultiStackReg), seleccionando Action 1: Align y Transformation: Rigid Body corregir ligeras desviaciones que puedan haberse producido durante la adquisición. Guarde esta película 2D como un archivo nuevo (.tiff).
2. Procesamiento de datos
   1. Abre este nuevo archivo con Icy.
   2. Dibuja un R1 región de interés (ROI) de 35 μm de diámetro, centrada en el lugar de la inyección (identificada especialmente por la sombra de la pipeta y la distorsión creada en el momento de la inyección).
   3. Utilice el complemento ROI intensity evolution y mida la intensidad media a lo largo de tiempo en R1.
   4. Guarde los resultados en un archivo .XLS.
3. Cuantificación y representación de los resultados
   1. Para cuantificar la respuesta microglial a lo largo del tiempo, determine en cada punto de tiempo.
      Luego, los resultados se pueden representar como una cinética de la respuesta microglial, o en un punto de tiempo específico (ver Figure 3).

Figura 1: Detalles de la cámara de interfaz. (A) Esquema para la impresión 3D del portarebanadas. El diámetro exterior del soporte es de 7 cm. (B) Soporte de rebanadas de interfaz con la malla de nylon (flecha) que permite a los investigadores mantener las lonchas en la interfaz líquido-aire. (C) Dispositivo de cámara de interfaz que permite mantener las lonchas en un ambiente carbogenado (la flecha indica el tubo para burbujear) y humidificado antes de que se obtengan imágenes.

Figura 2: Detalles de la cámara de perfusión. (A) Esquema para la impresión 3D. El diámetro externo de la cámara de perfusión es de 5,9 cm. (B) La cámara de perfusión con la malla de nylon (flecha) que sostiene la rebanada, evita que toque el portaobjetos de abajo y permite que el aCSF fluya por encima y por debajo de ella. (C) Imagen del montaje en el microscopio de dos fotones. La micropipeta que administrará el compuesto localmente es visible a la derecha (asterisco). (D) Pipeta fotografiada en campo claro. La barra de escala = 60 μm.

Figura 3: Posición de la micropipeta en la rebanada. Ejemplo de una adquisición de una pila de imágenes (en el hipocampo de un animal de 30 días de edad) con una micropipeta llena de fluoresceína (1 μM). La fluoresceína permite ubicar la pipeta (asterisco) en las proyecciones máximas a lo largo de (A) el eje z o (B) el eje y. Observe en el panel B que, aunque más débiles en fluorescencia, también hay microglía debajo de la punta de la pipeta. En este ejemplo ilustrado, se ha utilizado la pila completa, incluidas las imágenes tomadas en la parte más superficial del corte, para las proyecciones. Barra de escala = 30 μm en el panel A y como se indica (cada graduación = 50 μm) en el panel B. El grosor z de la pila = 220 μm.

Figura 4: Ejemplos de experimentos subóptimos. Estas rebanadas han esperado más de 6 horas antes de obtener imágenes y han sido fotografiadas desde su superficie superior. (A) Ejemplo de una pila z con una gran cantidad de escombros (partículas fluorescentes más o menos redondas, pero con bordes irregulares; asteriscos) y microglía "tupida" (flechas), es decir, con numerosos pero cortos procesos. Obsérvese los terminales de proceso agrandados (puntas de flecha) que parecen conos de crecimiento axonal. El grosor z de la pila = 220 μm. Los otros dos paneles muestran dos subpilas de la misma rebanada, con (B) 1-30 planos z (z-espesor = 59 μm) y (C) 30-120 planos z (z-espesor = 180 μm). En los planos superiores (mostrados en el panel B), además de los grandes terminales de proceso y los escombros como en el panel A, hay microglía con cuerpos planos o protuberancias (estrellas) inusuales y grandes. En los planos más profundos (mostrados en el panel C), no hay escombros ni objetos planos, pero las celdas son tupidas (flechas) y la densidad es inusualmente alta. En conjunto, estas observaciones indican que la microglía no se encuentra en un estado normal.