Obtención de imágenes microscópicas de neuronas en una sección del cerebro de un ratón mediante tinción metálica de Golgi-Cox

Resumen

Fuente: Louth, E. L., et al. Obtención de imágenes de neuronas dentro de secciones gruesas del cerebro utilizando el método de Golgi-Cox. J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra la obtención de imágenes de neuronas en una sección gruesa del cerebro teñida con Golgi-Cox mediante el establecimiento de límites de enfoque superior e inferior y la captura de imágenes superpuestas. Se obtienen imágenes de múltiples ubicaciones para garantizar proyecciones neuronales detalladas, que se combinan para crear una representación en 3D.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Golgi-Cox Staining

1. Golgi-Cox Impregnation of Brains
   1. Haga la solución de Golgi-Cox de 1% (p/v) de dicromato de potasio, 0.8% (p/v) de cromato de potasio y 1% (p/v) de cloruro de mercurio disolviendo el dicromato de potasio y cromato de potasio por separado en agua de alta calidad. Mezcle las soluciones, agregue el cloruro de mercurio y filtre la solución final con papel de filtro de grado 1. Guarde la solución en la oscuridad hasta por un mes.
   2. Anestesia al ratón con isoflurano al 5%.
   3. Eutanasia al ratón por decapitación y extirpa rápidamente el cerebro.
   4. Coloque el cerebro en un frasco de centelleo de vidrio de 20 mL que contenga 17 mL de solución de Golgi-Cox e incube en la oscuridad a RT durante 25 d.
   5. Crioproteja el cerebro colocándolo en un tubo cónico de 50 mL que contenga 40 mL de crioprotector de sacarosa (30% (p/v) de sacarosa en tampón de fosfato 0.1 M, pH 7.4) en la oscuridad a 4 °C durante 24 h.
      NOTA: Los siguientes tres pasos opcionales pueden emplearse como alternativa al protocolo principal, con el fin de congelar el cerebro en esta etapa para su almacenamiento a largo plazo.
   6. Congela todo el cerebro sumergiéndolo en 200 mL de isopentano preenfriado en hielo seco.
   7. Coloque el cerebro congelado en un tubo cónico de 50 mL y guárdelo en la oscuridad a -80 °C.
   8. Cuando esté listo para continuar, descongele el cerebro colocándolo en un tubo cónico de 50 mL que contenga 40 mL de crioprotector de sacarosa y manteniéndolo en la oscuridad a 4 °C durante 24 h.
2. Brain Sectioning
   1. Retire el cerebro de la sacarosa y bloquéelo para seccionarlo cortando el cerebelo con una cuchilla de afeitar y dejando un borde plano en el extremo caudal restante del cerebro.
   2. Calentar agar (3% (p/v) en agua) hasta que se derrita, luego dejar enfriar hasta que esté ligeramente por encima de su punto de fusión.
   3. Coloque el cerebro en un pequeño plato de pesaje desechable con su extremo caudal hacia abajo, y agregue una cantidad suficiente de agar derretido para cubrirlo.
   4. Una vez que el agar se haya solidificado, recorte el exceso de agar, dejando aproximadamente 2 - 4 mm alrededor del cerebro, y pegue el cerebro a la etapa de un vibratomo con su extremo caudal hacia abajo usando una pequeña cantidad de pegamento de cianoacrilato de etilo.
   5. Llene el área de la etapa del vibratomo con una cantidad suficiente de crioprotector de sacarosa para cubrir el cerebro, y corte el cerebro con un grosor de corte de 400 - 500 μm (dependiendo de la región del cerebro a examinar) utilizando una frecuencia de vibración de 86 Hz y una velocidad de avance de la cuchilla de 0.125 mm/s.
   6. Con un pincel pequeño, coloque secciones de cerebro en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos que contenga insertos de fondo de malla disponibles comercialmente y precargada con 10 mL de sacarosa al 6% (p/v) en tampón de fosfato 0.1 M, pH 7.4.
   7. Incubar secciones en la oscuridad a 4 °C O/N.
3. Developing Brain Sections
   1. Transfiera secciones de cerebro a un nuevo pocillo que contenga 5 mL de 2% (p/v) de paraformaldehído (PBD) en tampón de fosfato de 0.1 M, pH 7.4, utilizando los insertos de fondo de malla. Incuba en una mecedora, moviéndote lentamente en la oscuridad a RT durante 15 min.
   2. Las secciones deben lavarse dos veces transfiriéndolas a nuevos pozos que contengan 5 mL de agua. Deben lavarse en un balancín que se mueva a una velocidad moderada en la oscuridad a RT durante 5 min.
   3. Transfiera secciones a un nuevo pozo que contenga 5 mL de hidróxido de amonio al 2,7% (v/v). Incuba en una mecedora, moviéndote lentamente en la oscuridad a RT durante 15 min.
   4. Las secciones deben lavarse dos veces transfiriéndolas a nuevos pozos que contengan 5 mL de agua. Deben lavarse en un balancín que se mueva a una velocidad moderada en la oscuridad a RT durante 5 min.
   5. Transfiera las secciones a un nuevo pocillo que contenga 5 mL de Fijador A diluido en agua 10 veces más de su concentración original comprada. Incuba en un balancín, moviéndote lentamente en la oscuridad a RT durante 25 min.
   6. Las secciones deben lavarse dos veces transfiriéndolas a nuevos pozos que contengan 5 mL de agua. Deben lavarse en un balancín que se mueva a una velocidad moderada en la oscuridad a RT durante 5 min.
4. Mounting Brain Sections
   1. Con un pincel pequeño, monta secciones en portaobjetos de microscopio. Con unas pinzas y un pañuelo pequeño, retire el exceso de agua y agar. Asegúrese de eliminar todo el agar antes de proceder con la deshidratación.
   2. Permita que las secciones se sequen al aire en RT durante aproximadamente 45 min (secciones de 400 μm) o 90 min (secciones de 500 μm).
      NOTA: El momento y el nivel adecuado de sequedad son críticos y puede ser necesario determinar en cada laboratorio dependiendo de la temperatura ambiente y la humedad. Un tiempo de secado demasiado corto hace que las secciones se caigan de los portaobjetos durante las etapas de deshidratación posteriores, y un tiempo de secado demasiado largo conduce al agrietamiento de las secciones. Las secciones aún parecerán brillantes con el nivel adecuado de sequedad.
   3. Tiñe las secciones con violeta cresyl colocando portaobjetos en los frascos de tinción Coplin como se indica.
      NOTA: Este paso opcional puede emplearse para secciones que nunca se han congelado para teñir núcleos neuronales con violeta cresyl. Hemos encontrado que limpiar y rehidratar las secciones antes de la incubación en violeta de cresilo conduce a una tinción uniforme y un fondo bajo en todas las secciones.
      1. Colocar en el agente de compensación durante 5 min. Repita una vez.
      2. Coloque en etanol al 100% durante 5 min. Repita una vez.
      3. Coloque el 95% de etanol en agua, luego el 75% de etanol en agua y luego el 50% de etanol en agua durante 2 minutos cada uno.
      4. Colocar en agua durante 5 min.
      5. Colocar en 0.5% (w/v) de cresyl violet en agua durante 7 min.
      6. Coloque en agua durante 2 min. Repita una vez.
   4. Deshidrata las secciones colocando portaobjetos en frascos de tinción Coplin como se indica.
      1. Coloque en etanol al 50% en agua, luego al 75% de etanol en agua y luego al 95% de etanol en agua durante 2 minutos cada uno.
      2. Coloque en etanol al 100% durante 5 min. Repita una vez.
      3. Coloque en el agente de limpieza durante 5 min. Repita una vez.
         NOTA: Estos tiempos de deshidratación y limpieza son suficientes para procesar cerebros de ratón como se describe en este manuscrito. Sin embargo, hemos observado que para otras especies, incluidas las ratas y los tordos, el paso final de limpieza puede necesitar extenderse hasta 15 minutos en total.
   5. Secciones de cubreobjetos utilizando un medio de montaje anhidro.
   6. Permita que las diapositivas se sequen horizontalmente en la oscuridad en RT durante al menos 5 d.

2. Imágenes de Neuronas Manchadas dentro de Secciones Gruesas del Cerebro

1. Capturing Image Stacks
   1. Enciende la bombilla del microscopio, la cámara y el controlador de escenario.
   2. Abre el software del microscopio (por ejemplo, Neurolucida).
   3. Coloca un portaobjetos en la platina del microscopio.
   4. Capture una imagen panorámica 2D de la sección del cerebro utilizando un objetivo de bajo aumento como 1.25X 0.4 N.A. PlanAPO o 4X 0.16 N.A.
      1. Enfoca la imagen y ajusta la configuración de la cámara, incluyendo el tiempo de exposición y el balance de blancos.
      2. Crea un punto de referencia haciendo clic izquierdo en cualquier parte de la sección
      3. Captura la imagen seleccionando "adquirir una sola imagen" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
   5. Captura pilas de imágenes de resolución media del área que contiene la(s) neurona(s) de interés utilizando un objetivo 10X 0.3 N.A. UPlan FL N.
      1. Enfoca la imagen y ajusta la configuración de la cámara, incluyendo la exposición y el balance de blancos.
      2. Establezca los límites superior e inferior para la pila de imágenes enfocándose en la parte superior de la sección y seleccionando "set" junto a "top of stack" dentro de la ventana de adquisición de imágenes, y luego enfocándose en la parte inferior de la sección y seleccionando "set" junto a "bottom of stack" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
      3. Establezca la distancia de paso a 5 μm ingresando "5 μm" junto a "distancia entre imágenes" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
      4. Capture la pila de imágenes seleccionando "adquirir pila de imágenes" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
      5. Repita los pasos anteriores para capturar toda el área de interés, asegurándose de que todas las pilas de imágenes se superpongan en al menos un 10% en los ejes X e Y.
   6. Captura pilas de imágenes de alta resolución del área que contiene la neurona de interés utilizando un objetivo de inmersión en aceite de silicona 30X 1.05 N.A.
      1. Aplique 3 - 4 gotas de aceite de inmersión de silicona en el portaobjetos y coloque el objetivo sobre el portaobjetos, asegurando el contacto entre el objetivo y el aceite.
      2. Enfoca la imagen y ajusta la configuración de la cámara, incluyendo la exposición y el balance de blancos.
      3. Establezca los límites superior e inferior para la pila de imágenes enfocándose en la parte superior de la sección y seleccionando "set" junto a "top of stack" dentro de la ventana de adquisición de imágenes, y luego enfocándose en la parte inferior de la sección y seleccionando "set" junto a "bottom of stack" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
      4. Establezca la distancia de paso a 1 μm ingresando "1 μm" junto a "distancia entre imágenes" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
      5. Capture la pila de imágenes seleccionando "adquirir pila de imágenes" dentro de la ventana de adquisición de imágenes.
      6. Repita los pasos anteriores para capturar toda el área de interés, asegurándose de que todas las pilas de imágenes se superpongan en al menos un 10% en los ejes X e Y.
   7. Guarde el archivo de datos y todos los archivos de imagen en formato TIFF para su procesamiento externo.
2. Creating Z-projection Images and Image Montages
   1. Create Z-projection images in ImageJ
      1. Abra el software ImageJ que tiene instalado el complemento Bio-Formats.
      2. Selecciona "Plugins" -> "Bio-Formats" -> "Bio-Formats Importer."
      3. Seleccione el archivo de pila de imágenes que desea abrir.
      4. Una vez abierto el archivo, cambia el formato a RGB seleccionando "Imagen" -> "Tipo" > "Color RGB".
      5. Crea la proyección Z seleccionando "Imagen" -> "Pilas" -> "Proyecto Z...".
      6. Guarde la imagen de proyección Z bidimensional como un archivo TIFF.
   2. Crea un montaje de imagen bidimensional de toda el área de interés.
      1. Abre el software (por ejemplo, Adobe Photoshop).
      2. Selecciona "Archivo" -> "Automatizar" -> "Photomerge".
      3. Seleccione "Examinar" y luego agregue todos los archivos de imagen a fusionar.
      4. Asegúrese de que "Fusionar imágenes" esté seleccionado y luego seleccione "OK".
      5. Guarde la imagen de montaje resultante de toda el área de interés como un archivo TIFF.

Materiales