Imágenes de la activación neuronal del hipocampo en secciones del cerebro de ratón

Resumen

Fuente: Provenzano, G., et al. Visualización inmunohistoquímica de la actividad de las neuronas del hipocampo después del aprendizaje espacial en un modelo de ratón de trastornos del neurodesarrollo. J. Vis. Exp. (2015)

Este video muestra imágenes inmunohistoquímicas para visualizar la activación neuronal del hipocampo. Las secciones cerebrales teñidas revelan regiones más oscuras bajo un microscopio de campo claro, lo que indica neuronas activadas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Inmunohistoquímica

1. Transfiera de 3 a 5 secciones del hipocampo dorsal de cada ratón a 24 placas de pocillos múltiples que contengan 500 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,1 M para cada pocillo.
2. Lavar las secciones contenidas en cada pocillo con 500 μl de PBS 0,1 M (5 min, 3 veces agitando suavemente).
3. Extinguir la actividad de la peroxidasa endógena incubando secciones en peróxido de hidrógeno al 1% (H₂O₂) en PBS durante 20 min con agitación suave.
4. Lavar las secciones en PBS de 0,1 M con agitación suave (3 x 5 min).
5. Permeabilización de tejidos: incubar secciones durante 5 min en Triton X-100 al 0,2% en PBS.
6. Durante los pasos anteriores (1,4; 1,5), haga suficiente tampón de bloqueo (10% de suero de cabra y 0,1% de Triton-X100 en PBS) para todo el experimento (número de secciones x 100 μl x 3 pasos).
7. NOTA: Utilice suero de la misma especie en la que se produjo el anticuerpo secundario (Ab) (conjugado con biotina).
8. Evite la unión inespecífica del anticuerpo incubando secciones en un tampón de bloqueo (100 μl/sección) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) con agitación suave.
9. Incubar secciones en quinasa regulada por señal extracelular (pERK) fosforilada primaria Ab diluida en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C, con agitación suave.
10. Lavar las secciones en PBS de 0,1 M con agitación suave (3 x 5 min).
11. Incubar con el Ab secundario conjugado con biotina (1:250) diluido en tampón de bloqueo (el mismo que se utiliza en el paso 1.6) durante 1 hora a RT con agitación suave.
12. Prepare el reactivo del complejo avidina-biotina (ABC) al mismo tiempo, ya que la avidina y la biotina requieren al menos 30 minutos a temperatura ambiente para que se encomelvan.
13. Prepare el volumen requerido de reactivo ABC de acuerdo con el protocolo del fabricante.
14. Lavar las secciones en PBS de 0,1 M con agitación suave (3 x 5 min).
15. Incubar secciones durante 45 min en RT con reactivo ABC.
16. Lavar las secciones en PBS de 0,1 M con agitación suave (3 x 5 min).
17. Para preparar una solución de trabajo de diaminobenzidina (DAB), todos los pasos que involucran DAB deben realizarse en la campana extractora, ya que el DAB es cancerígeno y teratogénico.
18. Transfiera la solución DAB a una nueva placa con una pipeta de transferencia de plástico.
19. Coloque las secciones en la placa que contiene la solución de trabajo DAB y agite lentamente la placa con la mano para permitir la máxima exposición a las secciones.
20. Monitoree la reacción de DAB en el microscopio hasta que se desarrolle la señal adecuada (2-5 min).
21. Detenga la reacción con la intensidad de color deseada lavando el pañuelo en 0,1 M PBS (3 x 5 min).
22. Use lejía para desactivar cualquier resto de solución de sustrato DAB en la campana extractora durante la noche y deséchela de acuerdo con las pautas del laboratorio.
23. Monte secciones en portaobjetos recubiertos de gelatina flotándolos en PBS. Luego, séquelos a temperatura ambiente durante al menos 3-4 horas.
24. Deshidrate las secciones secuencialmente en etanol al 50%, 70%, 95% y 100% durante 2 minutos cada una y aclare en xileno al 100% durante 5 minutos.
25. Cubra el cubreobjetos con medio de montaje y déjelo secar en una campana extractora durante la noche.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
24 well plate	Sigma	CLS3524
100% etanol	Fisher Scientific	A406-20	Se utiliza para hacer gradiente de etanol para la deshidratación antes del montaje de la corredera.
Xylene	VWR	66004-950	Toxic - para usar bajo el capó. Cambie el xileno cada mes según el uso.
PBS	Sigma	P3813-10PAK
Triton X-100	Sigma	T-8787
Hydrogen peroxide	Sigma	H1009-100ML
Normal goat serum	Abcam	G9023-10ML
ABC kit Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100	Añadir en un volumen de 5 ml de PBS 2 gotas de reactivo A, mezclar y luego añadir 2 gotas de reactivo B y mezclar.
DAB peroxidasa substrate	Vector Laboratories	SK-4100	Añadir en un volumen de 5 ml de agua bidestilada: 2 gotas de solución de material tampón y mezclar; 4 gotas de DAB y mezclar; 2 gotas de peróxido de hidrógeno y mezclar.
pERK antibody	Cell Signaling Technologies	4370	Dilution 1:500
Biotinylated goatat anti-rabbit IgG antibody	Vector Laboratories	BA-1000	Dilution 1:250
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879
Coverslips	Fisher	12-548-B
DPX	Sigma	317616	Medio de montaje para diapositivas. Se puede utilizar un medio de montaje equivalente.