Obtención de imágenes de la dinámica intracelular del ATP mediante sensores basados en FRET en un corte organotípico del hipocampo de un ratón

Resumen

Fuente: Lerchundi, R., et. al. Obtención de imágenes de ATP intracelular en cortes de tejido organotípico del cerebro de ratón utilizando el sensor ATeam1.03YEMK basado en FRET. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra el uso de sensores basados en FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) para medir los niveles intracelulares de ATP en cortes de hipocampo de ratón organotípicos, lo que permite la visualización en tiempo real de la dinámica del ATP en neuronas y astrocitos en condiciones fisiológicas y experimentales.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Imágenes de ATP basadas en FRET (Figura 1)

1. Antes del experimento, prepare E-ACSF y burbujee con 95% de O₂/5% de CO₂ durante al menos 30 minutos para obtener un pH de 7,4. Encienda la fuente de luz fluorescente (lámpara de xenón) del monocromador (Figura 1). Inicie la perfusión justo antes de sacar la rebanada de la incubadora.
   NOTA: Mantenga la solución salina burbujeada con un 95% de O₂ y un 5% de CO₂ durante todo el experimento.
2. Transfiera el corte a una cámara experimental que se perfunde constantemente con E-ACSF recién carbogenado utilizando una bomba peristáltica (Figura 1). Luego, fije la rebanada con una cuadrícula. Coloque la cámara en la platina del microscopio y conecte el sistema de perfusión. Se recomienda el uso de tubos de laboratorio a prueba de gas para la perfusión.
   NOTA: Los experimentos pueden realizarse a temperatura ambiente o cerca de la temperatura fisiológica, dependiendo del diseño experimental. Comprobar la estabilidad y fiabilidad del flujo de perfusión para evitar cambios de enfoque inducidos por el movimiento del tejido y/o cambios en la tensión de cizallamiento. Las velocidades de perfusión estándar para el trabajo de corte, utilizadas por nosotros y muchos otros laboratorios, son de 1,5-2,5 mL/min.
3. Enfoque el corte cultivado utilizando una luz de transmisión. Identifique el área donde se realizarán los experimentos (por ejemplo: la región CA1 del hipocampo). Antes de comenzar los experimentos de imagen, espere al menos 15 minutos para permitir que las rodajas se adapten a las condiciones salinas. Para la configuración de la configuración experimental, véase Figura 1.
4. Encienda la cámara y el software de imagen. A continuación, seleccione el cubo de filtro adecuado.
5. Excite la proteína fluorescente del donante (eCFP) a 435/17 nm (~435 nm). Ajuste el tiempo de exposición entre 40 y 90 ms.
   NOTA: La exposición fuerte de las rodajas a la luz fluorescente puede provocar efectos fototóxicos.
6. La excitación a 435 nm da como resultado una emisión tanto a 475 nm (eCFP; donante) como a 527 nm (Venus; aceptor). Divida la emisión de fluorescencia a 500 nm con un divisor de imagen de emisión y emplee filtros de paso de banda a 483/32 y 542/27 para aislar aún más la fluorescencia del donante y del aceptor. Una expresión fuerte puede dar lugar a la saturación de los detectores. En este caso, puede utilizar un filtro de densidad neutra para reducir la intensidad de la excitación.
7. Seleccione una región de interés (ROI) aparentemente desprovista de fluorescencia celular para la sustracción de fondo. A continuación, cree ROI delineando los cuerpos de las células.
8. Establezca la frecuencia de adquisición de imágenes y el tiempo total de grabación. Para experimentos largos (>30 min), se recomienda una frecuencia de adquisición de 0,2-0,5 Hz para prevenir la fototoxicidad.
9. Inicia la grabación. Se recomienda registrar al menos 5 minutos en condiciones de referencia para garantizar la estabilidad de la preparación.
   NOTA: Ajuste el enfoque de la celda durante la grabación si es necesario.

Resultados

Figura 1: Configuración de la configuración de imágenes FRET. (A) Ilustración esquemática de los diferentes componentes y su disposición espacial necesaria para la configuración d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-deoxyglucose	Alfa Aesar	L07338	Análogo
Filtros de paso de banda 483/32	AHF Analysentechnik AG		Filtro
Filtros de paso de banda 542/27	AHF Analysentechnik AG		Filtro de emisión compatible con divisor
Divisor de haz T 455 LP	AHF Analysentechnik AG		Excitation dichroic mirror
Beamsplitter T 505 LPXR	AHF Analysentechnik AG		Splitter dichroic
Procesamiento de datos Origin Pro 9.0.0 (64- bit)	OriginLab corporation		Software de análisis de datos
D-glucosa monohidratado	Caelo	2580-1kg
DPBS	GIBCO/Life	14190250	Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco
Eclipse E 600FN upright microscope	Nikon Microscope Solutions			Eclipse FN1 upright microscope	Nikon Microscope Solutions
Experimental chamber	custom build		Cámara de perfusión para imágenes
Hanks' Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H9394	Con rojo de fenol para el control
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma-Aldrich	M7278	Synthetic cell culture media
Monochromator Polychrome V	Thermo Scientific/FEI		Ultra rápido monocromador de conmutación
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0	Nikon Microscope Solutions		<	NIS Elements 4.50 advanced Research	Nikon Microscope Solutions	td style='width:318pt;'
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics		Digital CMOS camera
Perfusion tubing	Pro Liquid GmbH		Tygon tubeing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85)
Photoshop CS 6 Version 13.0	Adobe		Image processing software
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)	ETH Zürich	v244	Vector AAV monocatenario que induce la expresión de ATeam1.03YEMK bajo el control del fragmento promotor de sinapsina 1 humano hSyn1.
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)	ETH Zürich	v307	Vector AAV monocatenario que induce la expresión de ATeam1.03YEMK bajo el control del fragmento promotor de proteína ácida fibrilar glial humano ABC1D.

de glucosa no metabolizable de emisión compatible con divisor y gráficos científicos de células vivas del pH >Software de imagen. Versión mejorada para FRET imaging