Imágenes in vivo de dos fotones de la retina del ratón

Resumen

Fuente: Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (2021).

Este video muestra una técnica para obtener imágenes de la retina in vivo utilizando microscopía de dos fotones. Los ratones anestesiados se preparan para la obtención de imágenes asegurando sus cabezas, aplicando lubricante ocular y colocando un cubreobjetos sobre el ojo. Las células ganglionares de la retina (CGR) que expresan proteínas fluorescentes se visualizan primero mediante epifluorescencia para la alineación. Por último, se emplean imágenes de dos fotones, lo que permite la visualización de alta resolución de los RGC.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación del ratón para la adquisición

1. de imágenesAnesthetizing mouse for imaging
   NOTA: Para mitigar la exposición al isoflurano, asegúrese de eliminar adecuadamente los gases residuales. Asegúrese de que el puerto de escape de la cámara de inducción de anestesia esté conectado a un recipiente de filtro de gas de barrido pasivo y que la salida de la boquilla de anestesia del ratón esté conectada a un recipiente de filtro de gas de barrido activo con un vacío proporcionado por un aparato de evacuación de gas. Siga las pautas del fabricante para controlar el peso del recipiente del filtro para su reemplazo.
   1. Anestesia al ratón usando el cóctel de ketamina/xilacina. Alternativamente, inducir la anestesia a través de la inhalación de isoflurano si también se usa isoflurano para el mantenimiento de la anestesia (sesión de imágenes > 30 min). Configure el dispositivo de anestesia para animales pequeños para llenar la cámara de inducción con isoflurano al 5% mezclado con aire ambiental a un caudal de 0,5 L/min. Coloque el ratón en la cámara de inducción y espere 15 segundos para que el ratón se anestesie.
   2. Cambia el vaporizador de isoflurano a 0% y dirige el flujo de anestesia a la pieza nasal. Realice un "lavado de O₂" de 5 segundos de la cámara de inducción. Saque el mouse de la cámara de inducción y asegúrelo en el soporte de la cabeza, colocando la pieza nasal.
   3. Utilice una mezcla de isoflurano al 1% con aire ambiente a un caudal de 0,5 L/min para el mantenimiento de la anestesia. Controle la frecuencia respiratoria a intervalos de 5 minutos durante la anestesia, ajustando el porcentaje de isoflurano para mantener una frecuencia respiratoria de ~60 respiraciones/min.
      NOTA: Estos ajustes (% isoflurano, caudal) también se pueden utilizar para el mantenimiento de la anestesia inducida por el cóctel de ketamina/xilacina.
2. Pupil dilation
   1. Prepare una solución de 1% p/v de atropina y 2.5% p/v de clorhidrato de fenilefrina en agua. Guarde la solución dilatadora a temperatura ambiente, protegida de la luz.
   2. Usando un gotero de pipeta desechable, aplique una gota de la solución dilatadora a cada ojo del que se tomará la imagen. Apague las luces de la habitación y espere 5 minutos para que la pupila se dilate. Cuando la pupila esté dilatada, seque la solución dilatadora con tejido sin pelusa.
      NOTA: Asegúrese de que la solución dilatadora no entre en las fosas nasales.
   3. Aplique una gota grande de gel lubricante para ojos en cada ojo que se va a fotografiar. Si se van a obtener imágenes de ambos ojos, aplique un pequeño trozo de película adhesiva de plástico sobre el gel ocular en el ojo que no permite obtener imágenes para evitar la deshidratación. Si solo toma imágenes de un ojo, aplique un ungüento lubricante para los ojos en el ojo que no se obtendrá de la imagen.
3. Posicionamiento del ratón para la imagen
   1. Para asegurar el ratón en el soporte de la cabeza de imagen, gire el brazo principal del soporte de la cabeza hasta que la barra del auricular esté inclinada en un ángulo de 60° o más por debajo de la horizontal. Asegure la clavija del canal auditivo inferior en la posición extendida hacia adentro y la clavija del conducto auditivo superior en la posición retirada.
   2. Con el ratón mirando hacia la barra de mordida, monta una oreja en el pin inferior extendido, insertando el pin en el canal auditivo. Afloje el tornillo que sujeta el orificio del canal auditivo superior y extienda el alfiler hacia el otro canal auditivo. Apriete el tornillo para asegurar la cabeza.
   3. Desliza la barra de mordida hacia la cabeza del ratón. Eleve suavemente la cabeza del ratón, luego baje los incisivos maxilares del ratón en el orificio de la barra de mordida. Retraiga la barra de mordida con una fuerza suave para asegurar la cabeza del ratón y asegure la posición de la barra de mordida apretando el tornillo.
   4. Si usa isoflurano, deslice la pieza nasal a través de su ranura en la barra de mordida antes de asegurar los incisivos del ratón. Asegure y apriete la posición de la barra de mordida como en el paso 1.3.3. Apriete la pieza nasal con los dos tornillos de su cara superior hasta que encaje perfectamente en la nariz del ratón, pero no apriete el hocico.
   5. Transfiere el ratón, en el soporte de la cabeza, a la platina del microscopio debajo del objetivo. Gire el brazo principal del soporte de la cabeza hasta que la pupila del ojo esté orientada hacia arriba, en línea con la trayectoria de la luz (Figura 1).
   6. Coloque un cubreobjetos #1.5 en el soporte de filtro compacto y fije el soporte a la platina del microscopio. Baje el cubreobjetos hacia el ojo, en contacto con el gel lubricante para ojos, de modo que quede horizontalmente inmediatamente por encima de la córnea (Figura 1). Asegúrese de que el cubreobjetos no toque la córnea.
      NOTA: En el microscopio, asegúrese de que la trayectoria de la luz de excitación esté configurada en epifluorescencia y la trayectoria de la luz de emisión esté configurada en el ocular. Encienda el iluminador de epifluorescencia a su potencia más baja y abra el obturador del iluminador. Elija la longitud de onda del iluminador de epifluorescencia y el filtro de fluorescencia correspondientes al fluoróforo que se está visualizando.
   7. Maniobra el escenario en las dimensiones X-Y y el objetivo en la posición Z utilizando el control de escenario y la unidad de enfoque motorizada hasta que la luz de excitación de campo amplio cubra completamente la córnea. Mirando a través del ocular, continúe ajustando la posición Z de la platina hasta que las células fluorescentes o las estructuras de la retina se enfoquen. Aumente la potencia del iluminador de epifluorescencia si la señal de la muestra no es lo suficientemente brillante como para resolver células individuales o estructuras de interés a través del ocular.
      NOTA: Si tiene problemas para localizar la retina, el iris es un punto de referencia de alto contraste para anclar y luego enfocar hacia la retina. Este paso también permitirá verificar que la pupila está dilatada al máximo.
   8. Obtenga un área de imagen en el eje con la lente del ratón. Ajuste el ángulo del ratón utilizando los distintos grados de libertad en el soporte de la cabeza hasta que solo se produzca la expansión o contracción de la luz desenfocada al ajustar el plano focal. Apague el iluminador de epifluorescencia y cierre el obturador del iluminador.
      NOTA: Un paralaje X-Y significativo de luz desenfocada mientras se desplaza por los planos focales de la dirección Z indica que la retina no está en el eje con respecto a la trayectoria de la luz de la imagen.

2. Adquisición

1. de imágenes de dos fotonesParámetros de configuración y adquisición de imágenes
   NOTA: Apague las luces de la habitación y cubra las fuentes de luz dispersas en la habitación. Asegúrese de que el iluminador de epifluorescencia esté apagado y que el obturador del iluminador esté cerrado.
   1. Cambia la ruta de la luz de excitación al láser y la ruta de la luz de emisión a los tubos fotomultiplicadores (PMT).
   2. En el software de adquisición de imágenes, establezca un tamaño de fotograma de 512 x 512 y un promedio de fotogramas de 3. Establezca los pasos por corte en -8 μm. Designe el paso en z para comenzar en la parte superior de la pila y progresar hacia abajo, minimizando la activación de los fotorreceptores con láser de dos fotones.
      NOTA: El tamaño del paso se puede reducir para aumentar la resolución Z a costa de un mayor tiempo de imagen, pero los pasos de 8 μm son suficientes para resolver somas celulares en esta configuración de imagen.
   3. Enciende y activa los PMT. Ajusta el voltaje PMT a 680 V. Activa el obturador de excitación.
      NOTA: Los PMT motorizados son susceptibles a daños leves. Asegúrese de que el iluminador de epifluorescencia esté apagado, que la cortina de la carcasa del microscopio esté cerrada y que las luces de la habitación estén apagadas.
   4. Comienza una vista previa de la imagen en vivo del tejido objetivo, comenzando con un 1% de potencia láser. Ajuste automáticamente el brillo de la pantalla para visualizar las celdas o estructuras de interés. Ajuste automático de la fase de escaneo. Si el tejido objetivo es tenue o poco claro, aumente el porcentaje de potencia del láser hasta que las estructuras se vuelvan visibles sin superar el límite establecido en el paso 2.4.4, que corresponde a 45 mW.
      NOTA: Para una imagen de 16 bits, un valor de visualización de ~1000 cuando se ajusta automáticamente el brillo en un plano Z que contiene estructuras de interés indica suficiente brillo de la muestra.
   5. Maniobra la platina del microscopio en la dirección X-Y para centrarla en un área de imagen deseada, luego navega hasta el plano Z con las estructuras de interés enfocadas.
      NOTA: Las imágenes adyacentes a la cabeza del nervio óptico le permiten servir como un punto de referencia inequívoco para los experimentos de imágenes crónicas.
   6. Si se trata de un experimento crónico de lapso de tiempo, abra una imagen anterior en el ordenador de adquisición y utilícela como referencia para encontrar la misma área de interés. Asegúrese de que el ángulo de la imagen sea similar al de las imágenes anteriores para adquirir el mismo conjunto de celdas con un paralaje mínimo.
      NOTA: Para obtener imágenes de las mismas celdas que en puntos de tiempo anteriores (Figura 2), es probable que se requiera un ajuste adicional de la posición de la cabeza del ratón.
   7. Establezca los límites Z de la pila de imágenes navegando a los planos Z superiores e inferiores de interés, y adquiera la imagen. Una vez finalizada la adquisición de la imagen, desactive los PMT y el obturador de emisión. Cambie la trayectoria de la luz de emisión de nuevo al ocular y la ruta de la luz de excitación a la iluminación de epifluorescencia. Retire el ratón de la platina del microscopio.

Resultados

Figura 1: Posicionamiento de ratones para imágenes in vivo. Para colocar el mouse con la pupila en el eje con la trayectoria de la luz, primero se sujeta el mouse anestesiado en un soporte para la cabeza, la cabeza se gira y se inclina, se coloca una gota grande de gel ocular lubricante en el ojo y el mouse se coloca en el escenario. En el portaobje...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
#1.5 coverslip	ThermoFisher	152440	Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm
50 mL jeringa de vidrio	Hamilton	80950	22G aguja cementada
Bomba de aire de anestesia	RWD Life Science	R510-30
Atropine	Sigma	A0132	Para solución
Basic Small Animal Anesthesia Device	RWD Life Science	R500IE
Capilar de vidrio de borosilicato	Sutter	B150-86-10	Diámetro exterior 1,50 mm, diámetro interior 0,86 mm, longitud 10 cm
CFP/YFP filter cube	Chroma	custom	480/40, 505 long pass, 535/30
ChromoFlex - Unidad de detección PMT de dos canales	Scientifica	S-MPLG-1002
Bomba de calor de circulación	Braintree Scientific	tp-700	Set to 37 °C
Película adhesiva	VWR	10713-916
Soporte de filtro compacto	ThorLabs	DH1	Sostiene el cubreobjetos sobre el ojo
Cx3cr1-GFP ratones transgénicos (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J)	The Jackson Laboratory	5582
DAQ chasis del controlador	National Instruments	PXIe-1073
Dispositivo de adquisición de datos	National Instruments	BNC-2090A
módulo FPGA con digitalizador	National Instruments	NI-5734
Aparato de Evacuación de Gas	RWD Life Science	R546W
GenTeal Severe gel lubricante para ojos	Alcon	(de la farmacia local)	Para usar durante la imagen
GFP/Red filter cube	Chroma	custom	535/30, 560 long pass, 605/70
Almohadilla térmica	McKesson Medical and Surgical 190147
HyperScope Launch Optics para usar con Pockels Cell	Scientifica	S-MP-101080
HyperScope Main module	Scientifica	S-MP-100466
HyperScope Scan Path	Scientifica	S-MP-100406
HyperScope X galvo	Module Scientifica	MP-100443
ImageJ Fiji software		Freeware
Isoflurano	Patterson Veterinary NDC	14043-704-06
Filtro de gas isoflurano (barrido activo)	RWD Life Science	R510-31
Filtro de gas isoflurano (barrido pasivo)	RWD Life Science	R510-31S
ketamina HCl (100 mg/mL)	Vedco	NDC 50989-161-06
M32 a M26 adaptador	ThorLabs	M32M26S
MaiTai GUI software	Spectra-Physics	NA
MATLAB software	MathWorks	NA	R2015b
meloxicam (5 mg/mL)	Boehringer Ingelheim	NDC 0010-6013-01	Analgésico
Micorscope Objective	Edmund Optics	46-404	Mitutoyo WE715042319
extractor de micropipetas	Sutter	Flaming/Brown Model P-97
Aceite mineral	Fisher	BP2629-1
Mini pinza hemostática bulldog	Fine Science Tools	18053-28
Tubo de EVA en miniatura 0.02" ID, 0.06" OD	McMaster Carr	1883T1
Tubo de EVA en miniatura 0.05" ID, 0.09" OD	McMaster Carr	1883T4
Soporte de cabeza de ratón	Narishige	SGM-4
No. 5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10
Postes ópticos 1/2"	ThorLabs	TR3-P5
Kit de medidor de potencia óptica	ThorLabs	PM100D
pE-300 Ultra LLG Deivery	Scientifica	COO-LED3ULLGs
Clorhidrato de fenilefrina	Sigma	P6126	Para solución
Pockels cell	Conoptics	350-80-02
Amplificador de células de Pockels	Conoptics	Model 302RM
Clorhidrato de proparacaína	Sigma	1571001	Para la
Red & Far Red short pass	filter Cube	Chroma custom	560 short pass
Abrazadera de poste giratoria de 1/2"	ThorLabs	SWC
Paquete ScanImage	Freeware de Vidrio Technologies		Software de adquisición de imágenes; Versión 5.4.0 (2018); requiere MATLAB
solución de cloruro de sodio, estéril (0.9%)	Fresenius Kabi	NDC 63323-186-01
Microscopio estereoscópico	Leica	S9 E
Centrífuga de sobremesa	Oxford	Benchmate C8
Terramicina oxitetraciclina/polimixina B antibiótico ungüento oftálmico	Zoetisus	NA	Para usar después de la inyección
Sistema de enfriamiento ThermoRack	Sistemas de enfriamiento de estado sólido	ThermoRack 401	Set to 20 °C
Ultrafast Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai DeepSee
Vgat-Cre ratones transgénicos (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)	El Laboratorio Jackson	16962
VGlut2-Cre ratones transgénicos (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J)	The Jackson Laboratory	16963
VivoScope for In Vivo Imaging	Scientifica	S-MPVS-1200-00P
Obertazo blanco de aceite mineral lubricante	Stye	NA	para uso después de la imagen
xilacina HCl (20 mg/mL)	Akorn	NDC 59399-110-20

dilatadora de pupila del ratón dilatadora de pupilas inmovilización ocular intravítrea