Imágenes de fluorescencia de la dinámica neuroinmune mediante un implante de cráneo

Resumen

Fuente: Bisht, K., et al. Mapeo cerebral preciso para realizar imágenes repetitivas in vivo de la dinámica neuroinmune en ratones. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra imágenes de fluorescencia de la dinámica neuroinmune en un ratón transgénico con un implante de cráneo. La estabilidad vascular y neuronal se visualiza junto con los cambios dinámicos de la microglía, lo que refleja las respuestas inmunitarias a la actividad neuronal.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación del ratón para la implantación

de la ventana cranealNOTA: Varias líneas de ratones transgénicos con etiquetas fluorescentes son adecuadas para la obtención de imágenes.

1. Utilice ratones CX3CR1GFP/+ para visualizar la microglía in vivo. Por lo general, se utilizan ratones juveniles a adultos jóvenes de 4 a 10 semanas de edad que pesan entre 17 y 25 g.
   NOTA: Aunque este enfoque es incluso apto para ratones pre-destetados, la necesidad de devolver a los ratones a sus jaulas con sus madres para alimentarlos puede complicar la recuperación si la madre no cuida adecuadamente a los cachorros después de la cirugía. Por lo tanto, se recomienda el uso de ratones después del destete.
2. Anestesiar al ratón usando isoflurano (5% de flujo en oxígeno para la inducción durante 1 min) en una cámara de anestesia. Compruebe que el ratón no muestra ningún movimiento o espasmos a los pellizcos de los dedos de los pies y/o la cola. Saque el ratón de la cámara y, al aire libre, afeite bien el vello de la cabeza entre las orejas desde el nivel de los ojos hasta la parte superior de la región del cuello con una recortadora de pelo.
   NOTA: La concentración de isoflurano utilizada dependería del tamaño de la cámara de inducción. Por lo tanto, para cámaras más pequeñas, se puede usar isoflurano al 3-4% para inducir la anestesia de manera efectiva, mientras que las cámaras más grandes requerirán hasta un 5%.
3. Mueva el ratón al cono de la nariz de la estación de cirugía estereotáctica para la anestesia (1.5-2% para el mantenimiento durante la cirugía), estabilice su cabeza usando barras para los oídos y mantenga el ratón en una almohadilla térmica para mantener su temperatura corporal caliente.
4. Lubrique ambos ojos con ungüento para ojos. Inyectar 100 μL de bupivacaína al 0,25% (para proporcionar analgesia local al ratón que durará 8-12 h) y 100 μL de 4 mg/mL de dexametasona (para reducir la inflamación que pueda resultar del procedimiento quirúrgico) por vía subcutánea en el sitio de la incisión. Deje que el mouse se asiente durante al menos 5 minutos antes de pasar al siguiente paso.
5. Limpia la cabeza afeitada con tres hisopos alternos de betadine y alcohol al 70%. Con una cuchilla quirúrgica o unas tijeras, haga una incisión en la línea media del cuero cabelludo que se extienda desde la parte posterior de la región del cráneo entre las orejas hasta el área frontal entre los ojos. La piel restante se corta para exponer el cráneo.
6. Limpia el tejido conectivo ubicado entre el cuero cabelludo y el cráneo subyacente con peróxido de hidrógeno al 3% <meta charset='utf-8'>(H₂O₂) y localizar el área del cerebro a visualizar con coordenadas estereotácticas.
   NOTA: A menudo hay algo de sangrado (paso 1.5) de la incisión en la superficie del cráneo. Este sangrado suele resolverse por sí solo en 3-5 minutos. La limpieza con el peróxido ayuda. También se observa que el tratamiento previo con bupivacaína (paso 1.4) limita la cantidad de sangrado durante este tiempo.

2. Cirugía de implantación de ventana craneal de ratón

1. Taladre una abertura circular de ~4 mm en el cráneo con una broca dental (0.7 mm de diámetro de punta) y retire cuidadosamente esta porción del cráneo con pinzas puntiagudas. Para obtener imágenes de la corteza somatosensorial de ratones de 6 a 8 semanas de edad, ubique el centro de la craneotomía en -2,5 posterior y ± 2,0 lateral al bregma. Durante la perforación, humedezca regularmente el cráneo con solución salina estéril e hisopos de algodón para enfriar el cerebro, limpiar los restos óseos y ablandar el hueso del cráneo para su eventual extracción.
   NOTA: Las coordenadas para la craneotomía variarían dependiendo de la región de interés y la edad de los ratones.
2. Después de extraer el cráneo, coloque cuidadosamente un pequeño cubreobjetos (tamaño #0 de 0.1 ± 0.02 mm de grosor) humedecido con solución salina en la craneotomía. Seque el exceso de solución salina con una toallita estéril.
3. Usando un aplicador puntiagudo (como la punta de una pipeta o el extremo puntiagudo de un bastoncillo de algodón de madera roto), aplique el pegamento de cianoacrilato alrededor de la ventana y deje que se adhiera al cerebro y al cráneo. Aplique el pegamento de imprimación en el resto del cráneo y cúrelo con una lámpara de polimerización durante 20-40 s. Prepare un hueco alrededor de la ventana con el pegamento final y cure con una luz de polimerización de 20-40 s.
4. Pega una pequeña placa de cabeza en el cráneo en el hemisferio contralateral de la craneotomía primero con el pegamento de imprimación como imprimación y luego con el pegamento final. Cura ambos con la lámpara de polimerización durante 20-40 s cada uno.
   NOTA: Las suturas son innecesarias si el cráneo se cubre con pegamento durante este procedimiento.

3. Post-surgery care

1. Permita que el ratón se despierte sin anestesia (la recuperación realizada en una almohadilla térmica acorta el tiempo de recuperación) y devuélvalo a su jaula de origen una vez que esté completamente despierto. Inyectar una dosis subcutánea de buprenorfina SR (0,5 mg/kg) como analgesia postoperatoria que sea suficiente para 72 h.
2. Para facilitar una recuperación saludable de la cirugía, proporcione al ratón comida extra blanda, como comida sólida regular empapada en agua para ablandarlo o comida en forma de gel.
   NOTA: Una provisión única de alimento blando inmediatamente después de la cirugía es suficiente.
3. Monitorea diariamente la salud del ratón y la recuperación adecuada durante las primeras 72 h del procedimiento quirúrgico. Posteriormente, las imágenes de la cirugía de implantación de ventana se realizarán a partir de las 2 semanas.
   NOTA: Si se hace bien, los ratones se recuperan bien mostrando comportamientos ambulatorios normales, suficiente exploración de la jaula, buena hidratación, aumento de peso estable e interacciones extensas con otros ratones en la jaula y otros elementos en la jaula. Los ratones que muestran letargo, deshidratación y pérdida de peso superior al 10% después de la cirugía son sacrificados y retirados del estudio.

4. Mapeo cerebral de dos fotones para la imagen inicial

1. Anestesiar al ratón (Isoflurano, 5 % de inducción y 1,5 % de mantenimiento). Estabilizar la cabeza con tornillos para montar la placa frontal en la platina del microscopio de dos fotones, manteniéndola en una placa calefactora a 35 °C. Inyectar intraperitonealmente 100 μL de colorante de vasos sanguíneos como la rodamina B (2 mg/mL).
   NOTA: Las imágenes también se pueden hacer en ratones despiertos sin anestesia. Sin embargo, estudios recientes indican que la anestesia afecta la dinámica de la vigilancia microglial. La fijación de la cabeza para la obtención de imágenes de dos fotones en ratones despiertos aumenta el estrés incluso durante la obtención de imágenes crónicas durante al menos 25 días.
2. Limpie suavemente la superficie de la ventana craneal con un bastoncillo de algodón humedecido en etanol al 70%. Ponga unas gotas de agua o solución salina en la ventana craneal y baje la lente del objetivo en la solución, ya que el objetivo es una lente de inmersión.
3. Dibuje a mano un mapa grueso para denotar los principales puntos de referencia de los vasos sanguíneos en un cuaderno de laboratorio mientras mira a través del ocular por epifluorescencia. Utilice este dibujo para identificar las regiones específicas durante la obtención de imágenes de dos fotones. Alternativamente, tome imágenes de los vasos sanguíneos a través de una cámara instalada en el microscopio o a través de una cámara de mano o un teléfono.
   NOTA: Estas imágenes y fotografías dibujadas a mano son para facilitar la revisita de las mismas regiones amplias bajo el microscopio antes de dos imágenes de fotones. No se trata de un mapeo de imágenes preciso.
4. Bajo dos imágenes de fotones, recopile imágenes de células y vasos fluorescentes según sea necesario. Tome notas cuidadosas con las coordenadas adecuadas para asegurarse de que las regiones precisas se puedan volver a visitar para obtener imágenes posteriores. Recoja varios campos de visión en esta sesión inicial de imágenes, por ejemplo, adquiera imágenes de pila z cada 1-2 μm a través de un volumen de tejido.
   NOTA: Al recolectar imágenes por dos fotones, los puntos de referencia de los vasos sanguíneos se utilizan para el mapeo aproximado. Si se necesita un mapeo fino, se utilizan dendritas marcadas con YFP de ratones Thy1-YFP.
   1. Utilice estos parámetros recomendados para la obtención de imágenes: una longitud de onda de 880-900 nm es óptima; para la excitación GFP y/o dsRed / Rhodamine, se utiliza un espejo dicroico de 565 nm con filtros de emisión de 525/50 nm (canal verde) y 620/60 nm (canal rojo); para la separación de GFP e YFP, se utiliza un espejo dicroico de 509 nm con filtros de emisión de 500/15 y 537/26 nm; la potencia en el cerebro se mantiene a 25 mW o menos; la resolución de la imagen es de 1024 x 1024 píxeles, el campo de visión tomado con un objetivo de 25X 0,9 NA con un factor de zoom de 1,5X es de 295,24 x 295,24 μm.
5. Al final de la imagen, retire el ratón del escenario, permita que se despierte de la anestesia y regrese a su jaula de origen hasta una futura sesión de imagen.

5. Imágenes de dos fotones y re-imaging

1. Para futuras sesiones de imágenes posteriores, que podrían ser desde unas pocas horas hasta meses después de la sesión de imagen inicial, anestesiar al ratón (isoflurano, 5% de inducción y 1,5% de mantenimiento), montar en el microscopio de dos fotones, mantener en una placa calefactora y volver a inyectar 100 μl un tinte de vasos sanguíneos como la rodamina B (2 mg/mL).
2. Abra las imágenes previamente obtenidas en ImageJ y, utilizando estas imágenes así como las notas de la sesión anterior, identifique las áreas previamente fotografiadas y vuelva a imaginarlas cuidadosamente.
3. Repita esto mientras la ventana de imagen esté despejada o como sea esencial para la extensión del estudio.

Materiales

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Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Coverglass (3mm)	Warner Instruments	64-0726
Pegamento de cianoacrilato (Krazy Glue)	Amazon<
Demi Ultra LED Curing Light System	Dental Health Products, Inc	910860-1
Dental Drill	Osada: www.osadausa.edu	EXL-M40
Broca	Fine Science Tools	#19008-07
Eye Ointment	Henry Schien	1338333
iBond Total Etch (Pegamento de imprimación)	Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)	66040094
Rhodamine B	Millipore Sigma	81-88-9 (R6626)
Tetris Evoflow glue (Pegamento final)	Top Dent (Ivoclar Vivadent)	#595956
Wahl Brav Mini+	Amazon<

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