Imágenes de fluorescencia de la dinámica del calcio en las uniones neuromusculares en el diafragma de un ratón transgénico

Resumen

Source: Heredia, D. J., et. al. Imágenes ex vivo de la señalización de calcio específica de la célula en la sinapsis tripartita del diafragma del ratón. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra imágenes de fluorescencia de la dinámica del calcio en las uniones neuromusculares (NMJs) en un ratón transgénico expresando indicadores de calcio codificados genéticamente. Un MNJ se identifica por receptores de acetilcolina marcados con fluorescencia en el diafragma con el nervio frénico. Un divisor de imágenes se utiliza para visualizar múltiples señales simultáneamente. Se administra un estímulo eléctrico y se registra el cambio en la fluorescencia en la NMJ en respuesta a la afluencia de calcio.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Preparación de los diafragmas y nervios frénicos de ratones transgénicos

1. Compre ratones transgénicos y cebadores de oligonucleótidos para genotipar estos ratones.
   1. Crría un ratón de 3 a 6 meses de edad que exprese una copia del alelo Cre-driver transgénico/knock-in apropiado y cero copias del alelo condicional GCaMP3/6 con un segundo ratón de la misma edad que exprese una o dos copias del alelo condicional GCaMP3/6 y cero copias del alelo Cre-driver.
   2. Genotipifique las crías y marque las que tengan tanto Cre como los alelos GCaMP3/6 condicionales, que a partir de ahora se denominarán ratones transgénicos dobles (por ejemplo, Myf5-Cre, GCaMP3 condicional).
      Nota: De esta manera, todos los datos se derivarán de ratones que expresen una copia de los alelos Cre y GCaMP3/6 condicionales. Esto es particularmente importante cuando se agregan otros ratones mutantes (por ejemplo, knockouts) a estos cruces.
2. Cuando los ratones doblemente transgénicos tengan la edad apropiada (por ejemplo, día postnatal 0 o 5 [P0 o P5] o adultos), eutanasiar a los ratones decapitándolos con tijeras (para ratones menores de P10) o colocándolos en una cámara de inhalación de isoflurano. Cuando ya no responden a pellizcar la cola con un par de pinzas, están listos para el sacrificio.
3. Sacrifica al animal por decapitación con unas tijeras.
4. Cortar transversalmente todo el animal, justo debajo del hígado y justo encima del corazón y los pulmones con tijeras de iridectomía.
5. Diseccione el hígado, el corazón y los pulmones, teniendo cuidado de mantener una longitud del nervio frénico que sea lo suficientemente larga como para ser introducida en un electrodo de succión (es decir, de 1 a 2 cm).
   Nota: El nervio frénico izquierdo se puede identificar como una pieza blanca de tejido que entra en la porción medial del diafragma izquierdo. No se debe cortar al extraer los pulmones. El nervio frénico derecho corre dentro de una pieza de fascia que también contiene la vena cava superior y es más delgada y blanca que la vena cava. Juntos, ambos penetran en el diafragma medial derecho.
6. Retire aún más la caja torácica y la columna vertebral, a excepción de la cresta delgada alrededor del diafragma.
7. Coloque el diafragma y la muestra de nervio frénico en un tubo de microfuga con solución de Krebs-Ringer con 1 μg/mL de 594-αBTX durante 10 minutos en la oscuridad.
   Nota: Esta concentración de 594-αBTX marca los receptores de acetilcolina (AChRs) sin bloquear su función (observación personal).

2. Estimulación y registro de los potenciales de acción muscular

1. Usando alfileres minuciosos, inmovilice el diafragma sujetándolo a un plato de 6 cm cubierto con gel dieléctrico de silicona y lleno con ~ 8 mL de solución Krebs-Ringer oxigenada y colóquelo en la platina del microscopio. Perfunda el diafragma con más solución de Krebs-Ringer (8 mL/min) durante 30 min.
   Nota: Esto enjuaga el 594-αBTX suelto, así como equilibra el tejido después de la disección.
2. Realizar un electrodo de succión según los métodos establecidos.
   1. Con un aumento de 4X, usando un micromanipulador, mueva el electrodo de succión sobre el nervio frénico izquierdo y aplique la succión sacando el cilindro de una jeringa de 5 mL conectada al tubo conectado al electrodo de succión.
      Nota: Cuando se introduce con éxito en el electrodo de succión, el nervio frénico está tenso. Encienda el estimulador y estimule el nervio frénico accionando el interruptor manual 1 vez.
   2. Asegúrese de que el diafragma se contraiga en respuesta a la estimulación de 1 Hz examinándolo visualmente con iluminación de campo claro. De lo contrario, ajuste el voltaje girando la perilla de voltaje gradualmente para lograr un pulso supramáximo, que se puede verificar mediante un examen visual de la contracción muscular. Si aún no es visible, sople el nervio con la jeringa e intente extraerlo nuevamente aplicando succión.
3. Apague la perfusión y agregue el inhibidor de miosina específico del músculo BHC6 o el antagonista del canal de sodio dependiente de voltaje μ-conotoxina8 hasta una concentración final de 100 μM.
   1. Para hacer 100 μM de BHC, pipetee 4 μL de caldo de 200 mM en DMSO y prediluya en 1 mL de solución Krebs-Ringer.
   2. Retire 1 ml de solución Krebs-Ringer del plato.
   3. Agregue el BHC prediluido al plato.
      Nota: Esta predilución ayuda a prevenir la inducción por DMSO sin diluir de una respuesta fluorescente no transitoria en las células que expresan GCaMP3.
   4. Espere 30 minutos y luego, encienda la perfusión de la solución fresca de Krebs-Ringer durante otros 20 a 30 minutos.
4. Prepare el electrodo de registro.
   1. Con guantes, coloque un vidrio filamentado de borosilicato con un diámetro exterior (OD) de 1 mm y un diámetro interior (ID) de 0,4 mm en un extractor de micropipetas, apriete los diales para sujetarlo en su posición y cierre la puerta del extractor.
   2. Con un extractor P-97, programe los siguientes ajustes: calor a 900, tiro a 120, velocidad a 75, tiempo a 250, presión a 500 y sin bucles adicionales.
      Nota: La resistencia (R) se mide utilizando los controles de software del amplificador: el software de adquisición de datos confirma la resistencia resolviendo la fórmula V = IR. El controlador de software hace pasar una corriente conocida (I) (normalmente 1 nA) a través del electrodo y mide el cambio en el voltaje (V), lo que nos permite resolver R.
   3. Para diafragmas embrionarios, asegúrese de que la resistencia esté cerca de 60 MΩ, y para diafragmas más antiguos, 10 - 20 MΩ. Cargue el electrodo de registro con cloruro de posatio (KCl) 3 M.
5. Con un aumento de 10X, baje el electrodo en el músculo, utilizando un segundo micromanipulador en el lado opuesto de la platina como electrodo estimulante.
6. Utilizando un software de adquisición de datos electrofisiológicos, espere hasta que el potencial de la membrana en reposo cambie de 0 a -65 mV o menos.
7. Estimular a 1 Hz y verificar la presencia de un potencial de acción muscular comprobando si hay un gran potencial que muestre un sobreimpulso modesto (potencial que se eleva por encima de 0 mV cuando comienza a -65 mV o menos). No hay que confundir un artefacto de estimulación con un potencial de acción.
   Nota: Los potenciales son significativamente más largos en duración (~5 ms) que los artefactos de estimulación.

3. Imagen de la fluorescencia de la muestra

1. Con un aumento de 20X, ubique la banda de la placa terminal en el centro del músculo buscando uniones neuromusculares marcadas con 594-αBTX o NMJ bajo excitación de luz verde/amarilla (550 nm). Cambie a la excitación de luz azul (470 nm) para obtener una imagen de las respuestas de Ca²⁺ en las células musculares, motoras o de Schwann.
2. Si lo desea, configure el divisor de imágenes con filtros de paso de banda y un filtro dicroico de un solo borde para obtener imágenes de doble longitud de onda.
3. Para calcular la fluorescencia máxima (Fmax) exhibida por el tejido que expresa GCaMP3/6, agregue 12 μL de cloruro de potasio (KCl) 3 M a las preparaciones de diafragma.
   1. Realice experimentos con la barra de brillo en la barra de la tabla de búsqueda configurada al 110% del nivel en el que el tejido que expresa GCaMP3/6 exhibe saturación con un aumento de 20X sin agrupamiento en respuesta a KCl.
4. Graba a 20 fotogramas por segundo para no perderte ningún evento rápido.
5. Estimular con 1 - 45 s de 20 - 40 Hz de estimulación nerviosa mediante la administración de una serie de impulsos utilizando el electrodo de succión o añadir agonistas farmacológicos mediante la aplicación de baño o por perfusión y recoger Ca²⁺ respuestas en un subtipo de célula junto con la señal estática 594-αBTX NMJ.
   Nota: Si los ratones indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) o indicadores de voltaje codificados genéticamente (GEVI) de rojo o rojo lejano específicos de tejido están disponibles para su uso en el NMJ, se pueden usar para recolectar dos señales dinámicas que reflejan dos elementos celulares distintos en el NMJ.
6. Cuando finalicen los experimentos de imagen o electrofisiológicos porque se hayan obtenido los resultados deseados, perfundir agua a través de las líneas de perfusión y aspirar agua 2 o 3 veces a través del electrodo de succión para asegurarse de que las sales no se acumulen.

Materiales