Imágenes de dispersión Raman estimulada a dos colores del tejido cerebral de ratón

Resumen

Fuente: Espinoza, R., et al. Imágenes de dispersión Raman estimuladas en dos colores en tiempo real del cerebro de ratón para el diagnóstico de tejidos. J. Vis. Exp. (2022).

El video muestra imágenes de dispersión Raman estimulada (SRS) de dos colores de secciones de tejido cerebral de ratón. Dos rayos láser sincronizados se dirigen a la sección del tejido para excitar vibraciones moleculares, lo que resulta en un cambio de intensidad relativa en los haces. Los lípidos y las proteínas en el tejido se detectan utilizando distintos pares de frecuencias de los rayos láser. A las señales resultantes se les asignan colores separados, creando una imagen de dos colores que ayuda a identificar las proteínas y los lípidos en el tejido.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Detección de señal SRS

1. Modulación electroóptica (EOM)
   NOTA: Se utiliza una EOM de 20 MHz para modular la amplitud de Stokes. Como se discutió más adelante, el EOM se deriva del tren de pulsos láser de 80 MHz, que se requiere para la modulación ortogonal. Se pueden utilizar otras frecuencias de modulación si sólo se realiza una SRS hiperespectral o de un solo color. En ese caso, no es necesaria la sincronización de la frecuencia de modulación con la frecuencia del láser. Se puede utilizar un generador de frecuencia con un amplificador de potencia de radiofrecuencia (RF) para impulsar EOM. Como resultado, se pueden omitir los pasos 1.1.1-1.1.4.
   1. Coloque un muestreador de haz en la trayectoria del haz de Stokes para recoger el 10% del haz y enviarlo a un fotodiodo rápido para detectar el tren de pulsos de 80 MHz.
      NOTA: La señal del fotodiodo se envía a un divisor de frecuencia para generar una salida TTL de 20 MHz. Esta salida se envía a un búfer de distribución ramificada para replicar la salida en cuatro salidas idénticas de 20 MHz. Una de las salidas se utiliza para activar el osciloscopio.
   2. Tome una de las salidas del búfer de distribución ramificada y fíltrala con un filtro de paso de banda para obtener una onda sinusoidal de 20 MHz. Utilice un atenuador de RF para ajustar el voltaje de pico a pico de salida a ~500 mV.
   3. Envíe la salida resultante a un desfasador, que permite un ajuste fino de la fase de RF con una fuente de voltaje. Envíe esta salida a un amplificador de potencia de RF y conecte la salida del amplificador a EOM.
   4. Desbloquee el haz de Stokes y optimice la profundidad de modulación de EOM1 colocando un fotodiodo en la trayectoria del haz. Ajuste el voltaje EOM y la placa de cuarto de onda hasta que la profundidad de modulación (relación valle-pico) parezca satisfactoria.
      NOTA: A una modulación de 20 MHz (1/4 de la tasa de repetición del láser), se esperan dos pulsos cada 50 ns.
2. Superposición temporal
   NOTA: La superposición temporal de la bomba y Stokes se logra retrasando uno de los dos trenes de pulsos láser con un retrorreflector montado en una etapa de retardo (La Figura 1 muestra el Stokes retrasado). La superposición gruesa se monitorea con el osciloscopio, y la superposición fina se monitorea mediante la señal SRS. También se puede lograr una superposición temporal fina con un autocorrelador si está disponible.
   1. Coloque un fotodiodo después del espejo dicroico para detectar el rayo láser. Bloquea primero el rayo de Stokes. Acérquese a uno de los picos de pulso de la bomba en el osciloscopio. Coloque un cursor vertical para marcar la posición temporal de este pico con el osciloscopio.
   2. Bloquee la viga de la bomba y desbloquee la viga de Stokes. Transfiera la etapa de retardo para que coincida temporalmente con la posición del pico en el osciloscopio a la posición marcada en el paso anterior. Véase Figura 2 para una visualización de la superposición temporal de dos vigas.
      1. (OPCIONAL) Si la traslación de la etapa de retardo es insuficiente para hacer coincidir temporalmente los dos haces, mueva la etapa de retardo a la mitad de su rango de movimiento.
      2. Calcule la distancia de retardo necesaria para hacer coincidir los dos haces tomando la diferencia temporal entre los dos haces y multiplicando la diferencia por la velocidad de la luz para encontrar la cantidad de distancia necesaria para hacer coincidir los dos haces temporalmente.
      3. Alargue la trayectoria del haz del haz más rápido o acorte la trayectoria del haz más lento para que coincida aproximadamente con el retardo temporal en consecuencia.
   3. Prepare una muestra de portaobjetos de microscopio con dimetilsulfóxido (DMSO) y cinta adhesiva de doble cara como espaciador para sostener la muestra entre el portaobjetos y un cubreobjetos.
   4. Coloque la muestra en el microscopio con el lado del cubreobjetos orientado hacia el objetivo del microscopio. Cambie el microscopio a una iluminación de campo claro y observe la muestra desde el ocular. Encuentre el foco de la muestra encontrando primero el foco en la capa superior e inferior de burbujas de aire en la interfaz de cinta de vidrio y, a continuación, mueva el foco para que quede entre las dos capas de cinta.
      NOTA: Asegúrese de que los rayos láser estén bloqueados antes de mirar dentro del ocular.
   5. Ajuste la salida del haz sintonizable a 798 nm. En función del rendimiento óptico del condensador, ajuste la potencia óptica para que sea de ~40 mW cada uno para la bomba y los haces de Stokes en el foco objetivo.
   6. Abra ScanImage en MATLAB (u otro software de escaneo que controle el microscopio) y haga clic en el botón etiquetado FOCUS para comenzar a escanear.
      NOTA: Los rayos láser se escanearán en trama a través de la muestra para generar una imagen. La salida de señal de baja frecuencia del fotodiodo (<100 kHz) se envía directamente al canal 1 de la tarjeta de adquisición de datos (denominado canal de CC). La salida de alta frecuencia (>100 kHz) del fotodiodo se envía al amplificador de bloqueo, y la salida X de la señal del amplificador de bloqueo se envía al canal 2 de la tarjeta de adquisición de datos (denominado canal de CA).
   7. Ajuste el espejo de dirección antes del escáner galvo para centrar la señal de CC en la pantalla del canal 1. Mueva la etapa de retardo motorizada y observe de cerca la salida de bloqueo que se muestra en la pantalla del canal 2 (es decir, el canal de CA).
      NOTA: Cuando la bomba y los Stokes coinciden en el tiempo, aparecerá una señal en el canal de CA. Es útil ajustar la escala de colores del canal de CA para mostrar el pequeño cambio de intensidad.
   8. Maximice la intensidad de la señal de CA ajustando finamente el retardo de tiempo. Ajuste el espejo dicroico para centrar la señal SRS en el canal de CA (mientras mantiene el canal de CC centrado). Ajuste la fase del amplificador de bloqueo para maximizar la señal. Véase Figura 3 para una señal satisfactoria.

3. Optimización de la resolución espectral

NOTA: La bomba y los haces de Stokes que alcanzan la muestra deben tener la misma cantidad de dispersión de retardo de grupo (GDD) para maximizar la resolución espectral. La dispersión depende en gran medida de la configuración experimental. La configuración experimental descrita aquí utiliza pulsos de femtosegundos a 1.040 nm y 800 nm como Stokes y bomba, respectivamente. Las varillas densas de vidrio de sílex (H-ZF52A) se utilizan como medio de estiramiento de pulsos.

1. Inserte 48 cm de una varilla de vidrio altamente dispersiva (H-ZF52A o vidrio de sílex denso equivalente) en la trayectoria del haz de 800 nm. Estime el GDD usando la Ecografía (1):

   

   NOTA: El GVD de varios materiales de vidrio a diferentes longitudes de onda se puede encontrar en el recurso de la base de datos de índice de refracción. Por ejemplo, H-ZF52A tiene un GVD de 220.40 fs²/mm a 800 nm. El GDD total es 105792 fs².

2. Calcule cuántos cm de la varilla de vidrio dispersivo se requiere agregar a la trayectoria del haz de 1.040 nm para que coincida con el GDD de la bomba. Inserte la longitud adecuada de varillas de vidrio dispersivo en la trayectoria del haz de 1.040 nm para que coincida aproximadamente con el GDD del haz de 800 nm. Tenga en cuenta que la adición de varillas de vidrio cambiará la superposición temporal de las dos vigas, y puede ser necesario ajustar el retardo.
3. Calibración de la resolución espectral
   1. Haga una muestra de portaobjetos de microscopio con DMSO. Coloque el portaobjetos en el microscopio y verifique la potencia de los haces que salen del condensador del microscopio. Ajuste la potencia en consecuencia para tener ~ 40 mW cada uno en el foco de muestra.
   2. Abra ScanImage desde MATLAB. Encuentre la señal SRS máxima escaneando a través de la etapa de retardo, que corresponde al pico Raman de 2.913 cm^-1 pico Raman de DMSO. Estime la posición de la etapa en función de la posición de la etapa anterior con el aumento de la longitud del camino óptico debido a la inserción de varillas. Vuelva a alinear la superposición espacial del haz debido a la pequeña desviación del haz cuando se agregan varillas de vidrio.
   3. Guarde un escaneo hiperespectral SRS tomando secuencialmente una serie de imágenes SRS mientras mueve la platina motorizada.
      NOTA: El rango de escaneo retardado cubre dos picos Raman, correspondientes a los picos Raman de 2.913 cm^-1 y 2.994 cm^-1 de DMSO, respectivamente. Estas dos transiciones se observan cuando se utiliza una bomba de 800 nm y un láser Stokes de 1.040 nm.
   4. Represente los espectros SRS de la solución DMSO utilizando ImageJ o MATLAB. Ajuste el pico DMSO grande de 2.913 cm^-1 a una función gaussiana o lorentziana en MATLAB para calcular el ancho total a la mitad del máximo (FWHM) del pico.
      NOTA: Los resultados representativos se muestran en Figura 4. Si solo hay un pico amplio, eso significa que la resolución espectral es demasiado pobre para distinguir los dos picos y se requieren más varillas de vidrio, o que el rango escaneado fue demasiado pequeño para detectar el segundo pico. Típicamente, una resolución espectral aceptable DMSO es ~20-25 cm^-1 cuando se utiliza una longitud de varilla de vidrio de >60 cm. A menudo se utiliza una resolución más baja para la obtención de imágenes de tejidos con el fin de intercambiar señales más altas con pulsos más cortos.
4. (OPCIONAL) Utilice un autocorrelador o un FROG (compuerta óptica resuelta en frecuencia) para determinar la duración del pulso de cada brazo para calcular exactamente la cantidad de GDD y la longitud de las varillas necesarias para que coincidan con el GDD entre la bomba y los Stokes.
5. Repita los pasos 3.3.2-3.3.4 para diferentes longitudes de varilla en el haz de Stokes para encontrar la resolución espectral óptima, lo que significa que se ha encontrado experimentalmente la mejor coincidencia de GDD. Utilice varios juegos de varillas de vidrio de diferente longitud para lograr una resolución espectral óptima.

4. Caracterización de la relación señal-ruido (SNR)

1. Asegúrese de que el paso 4.2 se realice después de la alineación espacial y temporal completa.
2. Adquiera una imagen SRS correspondiente al pico Raman de 2.913 cm^-1 pico Raman de DMSO. Abra la imagen en ImageJ y seleccione un área pequeña en el centro del marco. Utilice la función measure para calcular la media y la desviación estándar de los valores en el área seleccionada.

3. Divida el valor medio del área seleccionada por la desviación estándar para encontrar el valor SNR, como en Eq (2).

   

   NOTA: Una buena SNR para el sistema (con una constante de tiempo de bloqueo de 4 μs) que utiliza DMSO a 40 mw/40 mw en foco para ambos brazos es >800. Se pueden utilizar concentraciones más bajas de DMSO o menor potencia para una estimación más precisa de la SNR si la tarjeta de adquisición de datos tiene una profundidad de bits limitada.

4. Si la SNR es demasiado baja, vuelva a alinear los pulsos láser para optimizar la superposición espacial, la superposición temporal, la coincidencia de tamaño de haz/colimación y/o la coincidencia de dispersión. Para un objetivo con un collar de corrección de aberraciones, optimice la señal ajustando el collar de corrección.

5. Calibración del eje de frecuencia

NOTA: Este paso se realiza para relacionar la posición de la etapa de retardo con la transición Raman escaneada. Se requiere una selección cuidadosa de solventes para generar una "regla Raman" adecuada. El DMSO es un disolvente eficaz para los enlaces CH, ya que tiene dos picos Raman agudos a 2.913 cm^-1 y 2.994 cm^-1.

1. Guarde un escaneo hiperespectral con el rango de etapa de retardo que cubre los picos Raman de 2.913 cm^-1 y 2.994 cm^-1 de DMSO. Guarde las posiciones de las etapas correspondientes al conjunto de datos hiperespectrales.
   NOTA: El pico máximo global del espectro corresponde al DMSO 2.913 cm^-1 y el segundo pico máximo corresponde al DMSO 2.994 cm^-1 Desplazamiento Raman.
2. Realice una regresión lineal para las posiciones de la etapa y los desplazamientos Raman a 2.913 cm^-1 y 2.994 cm^-1. Usando la ecuación de regresión lineal que relaciona la posición de la etapa con el desplazamiento Raman, convierta las posiciones de retardo a las frecuencias Raman correspondientes.

6. Modulación ortogonal e imágenes a dos colores

NOTA: El paso de modulación ortogonal solo es necesario cuando se necesitan imágenes a dos colores en tiempo real. El esquema de este esquema se muestra en la Figura 5Figura 5. La modulación ortogonal utiliza un par de EOMs accionados a un cuarto de la frecuencia del láser (20 MHz para un láser de 80 MHz) con un desplazamiento de fase de 90° entre los dos. Este paso de modulación ortogonal se puede omitir para imágenes SRS de un solo color o imágenes SRS hiperespectrales.

1. Modulación EOM1
   1. Instale un divisor de haz polarizador (PBS2), una placa de cuarto de onda (QWP2) y un segundo EOM (EOM2) en la trayectoria del haz de Stokes después del primer EOM. Desconecte la entrada de señal a EOM2. Conecte la entrada de señal a EOM1 y enciéndalo.
   2. Modula el haz de Stokes (fijo a 1.040 nm) a 20 MHz (f₀/4) enviando el haz a través de la primera MOE. Ajuste la inclinación y la posición de EOM1 para asegurarse de que el haz incida en línea recta y centrado a través del cristal EOM.
   3. Monitoree la profundidad de modulación observando ambas polarizaciones que salen de PBS1 con dos fotodiodos y mostrando la modulación en un osciloscopio.
   4. Ajuste el QWP1, el voltaje EOM1 y la fase de la entrada de 20 MHz (mediante un desfasador) para optimizar la profundidad de modulación del haz transmitido para que esté cerca del 100%. Véase Figura 2B para una ilustración de una buena profundidad de modulación.
2. Modulación EOM2
   1. Desconecte EOM1 y conecte EOM2.
   2. Envíe la salida de alto voltaje del segundo amplificador a 20 MHz a EOM2. Ajuste la inclinación y la posición de EOM2 para asegurarse de que el haz incida directamente y centrado a través del cristal EOM.
   3. Una vez más, controle la profundidad de modulación observando ambas polarizaciones que salen de PBS2 con un osciloscopio. Ajuste el QWP2, el voltaje EOM2 y el desfasador según sea necesario para lograr una modulación cercana al 100% para ambas polarizaciones.
   4. Asegúrese de que la modulación del tren de impulsos tenga un desplazamiento de fase de 90° desde la primera modulación.
      NOTA: Si los dos trenes de impulsos de la bomba no son ortogonales a 90°, la diafonía entre los dos canales será un problema.
   5. Pruebe la ortogonalidad de la modulación activando y conectando EOM1 y EOM2. Monitoree ambas polarizaciones divididas por PBS2 con un osciloscopio. Reoptimice EOM1 y EOM2 individualmente si el tren de pulsos después del segundo PBS no se parece a Figura 2C.
   6. Instale un cristal de cuarzo birrefringente (BRC) de 20 mm y una placa de media onda (HWP) aguas abajo de EOM2. Conecte ambos EOM a la vez y monitoree el tren de pulsos de tal manera que se parezca a Figura 2D.
      NOTA: Para el chirrido utilizado en este experimento, 20 mm BRC induce un retardo de tiempo que corresponde a un desplazamiento Raman de 80 cm^-1. Es posible que se necesite una longitud de BRC diferente si se utiliza un chirrido diferente.
3. Calibración
   1. Calibra el sistema usando DMSO mediante la detección de señales de la salida de canal X e Y del amplificador de bloqueo (enviadas a los canales 2 y 3 de la tarjeta de adquisición de datos).
   2. Compruebe si las señales generadas por el pico de 2.913 cm^-1 pico de la polarización más rápida y el de la polarización más lenta están cerca de 90° desfasados en el amplificador de bloqueo. Si este no es el caso, ajuste la alineación EOM hasta que las dos señales estén cerca de 90° desfasadas.
   3. Una vez completada la calibración, encuentre la posición de retardo que sondea la transición de la proteína a 2.930 cm^-1 para uno de los haces ortogonales. Asegúrese de que la otra polarización sondea la transición lipídica de 2.850 cm^-1.

7. Imágenes SRS en modo epi

NOTA: En el esquema de imágenes del modo de transmisión, el objetivo enfoca el láser en la muestra y luego una lente de condensador dirige el haz transmitido a un fotodiodo para la detección de bloqueo. En el esquema de imagen en modo epi, la luz retrodispersada y despolarizada por la muestra es recogida por el objetivo de enfoque y aislada mediante un divisor de haz polarizado. Los fotones aislados y retrodispersados se envían a un fotodiodo a través de un par de lentes de relé para la detección de bloqueo. La figura 6 representa el esquema de imágenes en modo epi.

1. Instale un HWP antes de que el haz ingrese al microscopio para cambiar la polarización del haz que ingresa al microscopio. Coloque un PBS sobre el objetivo para permitir que el haz retrorreflejado despolarizado llegue al detector.
2. Utilice un par de lentes que constan de una lente acromática de 75 mm y una lente asférica de 30 mm para transmitir los fotones retrodispersados desde la apertura posterior del objetivo al fotodetector. Monte el detector para recoger la luz retrodispersada dirigida por el PBS. Instale un filtro para bloquear la entrada del haz modulado en el detector.
3. Coloque la muestra de tejido debajo del objetivo. Como el condensador no es necesario para la obtención de imágenes en modo epi, retírelo si se requiere más espacio.
4. Imagen
   1. Bloquea el haz con un obturador; ilumine la muestra desde un lado; y utilice el campo claro para encontrar el enfoque objetivo.
   2. Desbloquee ambos haces y utilice las posiciones de retardo precalibradas para adquirir imágenes SRS de lípidos y proteínas del tejido desde las dos salidas del amplificador de bloqueo.
   3. Ajuste la ganancia de bloqueo y el factor de agrupación de píxeles para obtener imágenes de buena calidad.

8. Tinción de color falso

1. Abra la pila de imágenes con ImageJ.
2. Saca las dos imágenes que corresponden a la especie lipídica (2.850 cm^-1) y proteína (2.930 cm^-1) haciendo clic derecho en la imagen y haciendo clic en Duplicado.
3. Cambie el nombre de la imagen lipídica a lípidos y la imagen de la proteína a proteínas.
4. Ir a Proceso | Calculadora de imágenes y realizar proteínas restar lípidos.
5. Combina las imágenes yendo a Image | Colores | Fusionar canales, ajustando lípidos a verde y proteínas a azul. Abra la herramienta canales de imagen (Imagen | Colores | Herramienta Canales) y ajustar el brillo y el contraste (Imagen | Ajustar | Brillo/Contraste).
6. Ajusta el brillo y el contraste de cada canal usando la herramienta channels herramienta. Para el canal de lípidos, ajuste el contraste hasta que las características celulares aparezcan oscuras. Para el canal de proteínas, ajuste el contraste hasta que las características celulares aparezcan azules. Convierta la imagen verde/azul del canal fusionado en una imagen RGB yendo a Image | Tipo | Color RGB. Exportar esta imagen por Archivo | Guardar como | Tiff.
   NOTA: Para la tinción falsa de H&E, el esquema de color muestra el citoplasma rosa, mientras que los núcleos son de color azul púrpura oscuro.
7. Descargue el script de MATLAB HE.m del recurso de script de tinción de H&E falso en la tabla de materiales Table of Materials.
8. Ejecute el script HE.m en MATLAB. Seleccione la imagen RGB exportada del paso anterior para generar una imagen teñida artificialmente con H&E.
9. (OPCIONAL) Normalice la intensidad de la imagen para imágenes de campo de visión grande, ya que la imagen aparece más oscura en la periferia que en el centro.
   1. Para realizar la normalización de campo de las imágenes, promedie tantas imágenes como sea posible. A continuación, elimine las características de intensidad con ImageJ (Process | Filtros | Desenfoque gaussiano | Radio=50).
   2. Mida la intensidad máxima de la imagen borrosa (Ctrl+M). Divide la imagen borrosa por la intensidad máxima (Proceso | Matemáticas | Dividir). Divida la imagen SRS sin procesar por la imagen borrosa (Proceso | Imagen | Calculadora).

Resultados

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Banda ancha, 650 - 1,050 nm, longitud focal de lente acromática, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Banda ancha, 650 - 1,050 nm, distancia focal de lente acromática, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic<	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic<	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Espejo dicroico	THORLABS	DMSP1000	Se pueden usar otros dicroicos con una longitud de onda central de alrededor de 1,000 nm.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich<	Solvente para la calibración del desplazamiento Raman. Se pueden utilizar otros disolventes con picos Raman conocidos.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Se necesitan dos EOM para la modulación ortogonal y la obtención de imágenes de doble canal. Se recomienda la versión resonante para que se pueda utilizar un voltaje de conducción más bajo.
False H&E Staining Script<		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, para generar la frecuencia de conducción de EOM y la referencia al lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider<	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divisor (f/2, f/4, f/8, f/16), para generando 20MHz de la salida del láser.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic<	Alta dispersión H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Sistema láser capaz de emitir dos láseres pulsados sincronizados (un haz fijo a 1.040 nm y un haz sintonizable, que va de 680 a 1.300 nm) con una tasa de repetición de 80 MHz.
Lock-in Amplifier<	Moku Lab	Amplificador de bloqueo para extraer la señal SRS del fotodiodo. También se puede utilizar un instrumento Zurich HF2LI o un instrumento similar.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Espejo dieléctrico de banda ancha, 750 - 1,100 nm. También se pueden utilizar espejos plateados.
Motorized Delay Stage<	X-DMQ12P-DE52	Etapa de retardo para el control fino de la superposición temporal de la bomba y los láseres Stokes. Cualquier otra etapa motorizada debería funcionar.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Se pueden utilizar otros condensadores con NA>1.2.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Cualquier otro osciloscopio con banda de 400 MHz o superior debería funcionar.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	Para cambiar la fase de la frecuencia de modulación
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Diodo PIN de silicio con área grande (10 x 10 cm2). Se pueden utilizar otros diodos con gran área y baja capacitancia.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic<	Divisor de haz polarizado de banda ancha
Refactive Index Database<		refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Se pueden utilizar otros prismas o retrorreflectores.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Bloque de ganancia, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	Usamos un conjunto de espejos de 5mm con recubrimiento plateado
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25,0 mm, longitud de onda de corte: 1.000 nm. Para una supresión eficiente de los Stokes, pueden ser necesarios dos filtros.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Se puede utilizar cualquier otro marco de microscopio. Si se dispone de un microscopio de barrido láser, se puede utilizar directamente. De lo contrario, era necesario añadir al microscopio un escáner galvo y una lente de exploración.
Water Immersion Objective<	XLPLN25XWMP2	El objetivo multiphoton 25X tiene un NA de 1.05. Se pueden utilizar otros objetivos similares.

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