Microscopía de dos fotones de astrocitos y neuronas excitadoras en un tejido del hipocampo de ratón aclarado

Resumen

Fuente: Refaeli, R., et al., Investigación de la interacción espacial entre astrocitos y neuronas en cerebros despejados. J. Vis. Exp. (2022)

El video muestra la preparación de una cámara y la neuroimagen del tejido del hipocampo de ratón aclarado mediante microscopía de dos fotones para visualizar las interacciones espaciales entre los astrocitos marcados con fluorescencia y las neuronas excitadoras.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Preparación de la cámara

NOTA: Cada muestra requiere un portaobjetos con una cámara de imágenes en la que se colocará la muestra.

1. Coloque la muestra en el centro del portaobjetos.
2. Con una pistola de pegamento caliente, crea paredes en los bordes del portaobjetos, casi tan altas como el tejido. Asegúrese de dejar un pequeño espacio (aproximadamente 5 mm) en una de las esquinas (Figura 1A, B).
3. Aplique 1-2 gotas de la solución de coincidencia de índice de refracción o RIMS sobre la muestra para mantener la superficie superior húmeda y evitar que se formen burbujas entre el cubreobjetos y el tejido.
4. Inmediatamente después de aplicar las gotas de RIMS (solución de coincidencia de índice de refracción), agregue la última capa de pegamento caliente a las paredes (para que alcancen la altura del cerebro/corte) y avance inmediatamente (mientras el pegamento caliente aún está líquido) al paso 1.5.
5. Selle la parte superior con un cubreobjetos, colocándolo lo más uniformemente posible sobre la parte superior de la capa de pegamento caliente aún caliente (Figura 1C).
6. Llene la cámara con los RIMS a través del espacio dejado en las paredes de pegamento caliente (Figura 1D, E).
7. Cierra el espacio con pegamento caliente. No dejar aire en el interior (Figura 1F).
8. Si las paredes de pegamento caliente se extienden más allá de los bordes de la guía, corte los bordes que se extienden (Figura 1G).
9. Si el objetivo utilizado para la toma de imágenes está sumergido, agregue otros 2-3 mm de pegamento a las paredes por encima del cubreobjetos para que la solución de inmersión dure más tiempo (Figura 1H).

Resultados

Materiales