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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Análisis morfológico de neuronas granulosas cerebelosas o CGN: reconstrucción tridimensional (3D) y área de superficie y volumen celular
- Imagen de CGN electroporadas individuales en un microscopio confocal a un objetivo de 63x con un zoom de 2x, tomando imágenes de pila z a 0,5 μm por pila. Imagen de una celda por ventana de imagen para permitir un fácil análisis y reconstrucción de la imagen.
- Instale el plug-in Simple Neurite Tracer para FIJI utilizando el siguiente enlace (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions) para trazar de forma fácil y eficiente la estructura de los CGN electroporados en un espacio tridimensional (3D).
NOTA: Hay una versión actualizada del plug-in (https://imagej.net/SNT).
- Analice la longitud de las neuritas y la formación de garras dendríticas de forma ciega utilizando un trazador simple de neuritas. Cargue imágenes de pila z de un solo canal de CGN electroporados en FIJI y haga clic en Complementos | Segmentación | Trazador simple de neuritas (Figura 1D).
- Acceda al menú desplegable y seleccione Crear nuevo visor 3D (Figura 1D).
- Desplácese hasta la base de una dendrita, donde se conecta a la célula soma, y comience un camino haciendo clic en la unión. Traza manualmente la ruta haciendo clic en las secciones donde la señal de relleno de celda es más brillante, pulsando [y] para mantener la traza. Traza hasta el final de la dendrita si no contiene una garra o hasta la base de la garra y confirma el camino presionando [f] (Figura 2D).
- A continuación, trace la garra iniciando un camino en la base de la estructura y trazando hasta el final de la nerita más larga. Trace las ramas secundarias y terciarias manteniendo pulsada la tecla [ctrl] en Windows o [alt] en un sistema operativo Mac y haciendo clic en la ruta. Confirme la ruta pulsando [f].
- Observe que las mediciones de las trazas son visibles en una ventana separada; Suma todas las medidas de las ramas de las garras (primarias, secundarias, terciarias) para obtener la longitud total de cada garra.
- Para analizar el área superficial y el volumen celular de los CGN electroporados, descargue el software de análisis de células Imaris (https://imaris.oxinst.com/).
NOTA: FIJI también se puede usar para reconstruir celdas en 3D a partir de imágenes de pila z utilizando complementos gratuitos y fácilmente disponibles. Además, Simple Neurite Tracer tiene una función de representación volumétrica, pero Imaris se utilizó por las razones que se describen a continuación.
- Cargue una imagen z-stack de un CGN electroporado en Imaris. Acceda al kit de herramientas de reconstrucción 3D pulsando Sobrepasar.
- Para reconstruir el CGN, presione Superficies y seleccione una región de interés que abarque la totalidad de la celda dentro de la ventana de la imagen. Una vez que haya terminado, presione la flecha azul hacia adelante en la esquina inferior derecha debajo de Crear.
- Si la imagen contiene varios canales para diferentes señales, seleccione el canal que contiene el CGN electroporado y presione la flecha azul hacia adelante.
- Usando la barra lateral, establezca el umbral deseado que se ajuste con mayor precisión a la señal de la celda electroporada. Acérquese más a la superficie de la celda para determinar con precisión el umbral. Una vez terminado, presione la doble flecha verde para reconstruir la celda y obtener el área de superficie y el tamaño del volumen a partir de los metadatos.
