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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
Imágenes in vivo de dos fotones de la microglía y la dinámica neuronal del calcio
1. Habituación de los ratones al aparato del microscopio
- Tres semanas después de la cirugía, se indujo la anestesia en el ratón con isoflurano al 3% y se colocó al ratón bajo la lente del objetivo de 25x de un microscopio de dos fotones utilizando un instrumento estereotáxico hecho a medida (Figura 1C). Para la configuración, el mouse se coloca en la parte superior de una cinta de correr y se le permite correr libremente.
- Aproximadamente 10 minutos después, retire el ratón de la etapa del microscopio y devuélvalo a la jaula de origen. Repita la habituación al menos 3 veces cada dos días antes de la adquisición de la imagen de dos fotones.
2. Adquisición de imágenes con dos fotones
NOTA: Recomendamos realizar la adquisición de imágenes más de 4 semanas después de la cirugía, ya que la activación microglial vuelve gradualmente al nivel basal.
- Inducir la anestesia en el ratón con isoflurano al 3% y colocar el ratón bajo la lente objetivo del microscopio de dos fotones utilizando un instrumento estereotáxico hecho a medida.
- Instale el dispositivo de sombreado hecho a medida (Figura 1A y Figura 1B) y un monitor LCD para la estimulación visual como se describe a continuación (Figura 1D).
- Coloca la lente para enfocar en la superficie del cerebro, y luego establece esta posición de la lente como la posición Z original. Mantenga constantes las coordenadas x-y y eleve la lente del objetivo; Retire el ratón y el instrumento estereotáxico de la lente del objetivo y de la cinta de correr.
- Coloque un dispositivo de sombreado en la parte superior de la placa principal con silicona, que se ennegrece mezclándola con polvo de carbón, y asegúrese de que el espacio entre la placa principal y el dispositivo de sombreado esté bien sellado.
- Llene el dispositivo de sombreado con agua destilada y luego vuelva a fijar el mouse y el marco estereotáxico debajo del objetivo y en la cinta de correr. Restablezca cuidadosamente el plano focal en la superficie del cerebro, verificando la profundidad de la lente del objetivo.
NOTA: Para evitar el riesgo de dañar la lente del objetivo, primero establezca las coordenadas xyz y luego aplique el dispositivo de sombreado de la lente del objetivo. También es razonable instalar primero la cubierta y luego ajustar las coordenadas, pero es necesario un manejo cauteloso para esta opción. - Cubra la lente del objetivo con papel de aluminio negro para evitar la contaminación de la luz del monitor LCD utilizado para la estimulación visual a través de la lente del objetivo (Figura 1D). Coloque un monitor LCD de 10 pulgadas a 12,5 cm frente a los ojos del ratón para presentar los estímulos visuales (Figura 1D).
- Configure los filtros de recolección de emisión de fluorescencia para fluorescencia EGFP (filtro de emisión de 525/50 nm) y fluorescencia R-CaMP (filtro de emisión de 593/46 nm) y la longitud de onda de excitación a 1.000 nm. Adquiera imágenes con una resolución espacial de 0,25 μm/píxel utilizando un objetivo 1,1 NA de 25x y PMT GaAsP.
- Encuentre la región de imagen en la que las neuronas R-CaMP (+) y la microglía EGFP (+) se pueden obtener imágenes simultáneamente en la capa 2/3. Para esta configuración, los datos obtenidos en la Figura 2 se realizaron a una profundidad de 100 μm desde la superficie del pial, utilizando una vista previa de la imagen en vivo. Mantenga la potencia del láser de excitación lo más baja posible para evitar el fotoblanqueo y el daño causado por el aumento de la temperatura local en la región de la imagen.
- Adquiera imágenes a la velocidad de fotogramas de 30 Hz. Simultáneamente con la adquisición de imágenes, presente estímulos visuales de rejilla a la deriva con un contraste del 100%, 1,5 Hz, 0,04 ciclos por grado en 12 direcciones a 6 orientaciones de 0° a 150° en pasos de 30° al ratón.
- Después de la adquisición de la imagen, retire el mouse de la etapa del microscopio, separe el dispositivo de sombreado y el instrumento estereotáxico del mouse y devuelva el mouse a su jaula de inicio.
