Cuantificación de neuronas recién generadas en tejido cerebral de rata mediante la técnica del fraccionador óptico

Abstract

Fuente: Olesen, M. V., et al. La técnica del fraccionador óptico para estimar el número de células en un modelo de rata de terapia electroconvulsiva. J. Vis. Exp. (2017).

El video muestra la técnica para cuantificar las neuronas recién generadas en el tejido cerebral. Los cortes de tejido del hipocampo que contenían neuronas marcadas con bromodeoxiuridina (BrdU) se tiñeron mediante inmunohistoquímica y posteriormente se cuantificaron a lo largo del espesor del tejido mediante la técnica de fraccionador óptico.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Procesamiento de tejidos

NOTA: Tras la perfusión transcardíaca y la postfijación en paraformaldehído (PFA) al 4% diluido en tampón de fosfato 0,2 M durante la noche a 4 °C, los cerebros se transfieren a sacarosa al 30% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante tres días a 4 °C. Después de eso, los cerebros se congelan en hielo seco en polvo y se almacenan a -80 °C hasta el corte.

1. Separa los hemisferios derecho e izquierdo a lo largo de la línea media del cerebro usando un bisturí. Luego, elige uno u otro hemisferio al azar en el primer cerebro. Después, cambia sistemáticamente entre los hemisferios derecho e izquierdo (Figure 1A). Monte la semiesfera muestreada en un disco de muestra con el eje largo perpendicular al disco utilizando un medio de montaje.
2. Coloque recipientes numerados de placas múltiples para el preenfriamiento en el criostato.
3. Monte el disco de muestra en el criostato y corte la totalidad del hipocampo (Bregma 1.80 a - 7.04) en secciones de 80 μm de espesor en el plano coronal (Figura 1B).
   1. Coloque todas las secciones muestreadas consecutivamente en los contenedores de platos múltiples enfriados para mantener las secciones en orden de corte.
   2. Cubra completamente las secciones con crioprotector y mantenga los recipientes a -20 °C hasta su uso posterior.

2. Inmunotinción

NOTA: Para realizar un seguimiento de las secciones individuales a lo largo del procedimiento de tinción, coloque las secciones muestreadas en redes de tinción de 25 pocillos. Utilizar cada 5ª sección, dando un número final medio de 12 (8-16) secciones por hipocampo para la inmunotinción y el posterior recuento de células.

1. Before subsampling cada n-ésima sección con un inicio aleatorio entre las secciones uno y n (Figura 1C), transfiera los contenedores de -20 °C a temperatura ambiente (RT).
2. Use un pincel, por ejemplo, para transferir las secciones en orden numérico a las redes de tinción de 25 pocillos colocadas en placas de Petri llenas de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   NOTA: A partir de este punto, mantenga las secciones de las mosquiteras colocadas en platos de vidrio a juego en un agitador orbital (secciones 2.3 a 2.9).
3. Transfiera las redes de tinción a los platos de vidrio correspondientes y lave las secciones dos veces durante 10 min en PBS a temperatura ambiente (RT) antes de incubar en peróxido de hidrógeno al 3% (H₂O₂) diluido en agua destilada (dH₂O) durante 20 min.
4. Transfiera las secciones a tres soluciones diferentes de ácido clorhídrico (HCl) (1 M a 0 °C durante 10 min, 2 M a RT durante 10 min y 2 M a 37 °C durante 20 min) antes de neutralizar en tetraborato de sodio 0,1 M a RT durante 20 min.
5. Después de 3 × 10 min de incubación en Triton X-100 al 1% diluido en PBS (tampón de lavado), transfiera las secciones a un tampón de lavado que contenga un 10% de suero fetal bovino (solución bloqueante) durante 1 h a RT.
6. Incubar las secciones durante 48 h a 4 °C en ratón-anti-BrdU (5-bromo-2'-desoxiuridina) diluido 1:100 en solución de bloqueo.
7. Lavar las secciones 3 × 10 min en tampón de lavado e incubar durante 48 h en peroxidasa de rábano picante diluida 1:10 en tampón de lavado.
8. Transfiera las secciones a PBS durante 5 × 10 minutos y luego durante 7 minutos en diaminobenzidina (DAB) al 0,01% diluido en PBS antes de ser transferidas a una solución DAB similar que contenga 0,02% H₂O₂ durante 10 min en RT.
9. Complete una serie de lavados (2 × 10 min en PBS y 2 × 10 min en tampón de fosfato sin cloruro de sodio añadido) y monte las secciones en orden numérico en portaobjetos de microscopio.
10. Seque las secciones durante aproximadamente 30 minutos antes de contratinirlas con violeta de cresyl.
11. Coloque los portaobjetos del microscopio en un estante de portaobjetos.
12. Rehidrata las secciones durante 10 min en platos de tinción de portaobjetos que contengan dH₂O, y luego transfiera las diapositivas a 0.02% cresyl violet en dH₂O durante 15 min.
13. Repita el paso 2.12 antes de que las secciones se deshidraten tres veces en etanol (96% durante 5 minutos y 99% durante 2 × 2 minutos).
14. Coloque las secciones en xileno durante 2 × 15 minutos y cubra los portaobjetos con un medio de secado rápido para el montaje.
15. Por último, deje los portaobjetos deslizantes durante aproximadamente 24 horas antes de que puedan utilizarse para la microscopía.

3. Estimación del número total de neuronas marcadas con BrdU utilizando el fraccionador óptico

NOTA: Realice un estudio piloto que incluya algunos animales para determinar los parámetros de muestreo óptimos, como el número de secciones a analizar y el número de disectores ópticos dentro de las secciones muestreadas. Este piloto también proporciona un CV preliminar (desviación estándar/media) y la posibilidad de ajustar la CE para obtener una precisión satisfactoria de las estimaciones determinadas por el investigador (para más detalles, ver más abajo). Del mismo modo, un análisis de distribución z abordará los siguientes puntos: contracción del tejido, calidad de la tinción a lo largo de la sección y distribución de las células en el eje z.

1. Verifique el grosor del tejido en las secciones para confirmar que son adecuadas para el uso del fraccionador óptico, por ejemplo, lo suficientemente grueso para la altura del disector elegido, incluidas las zonas de protección (ver más abajo). NOTE: El grosor del tejido se mide en varios lugares dentro de la región de interés.
   1. Coloque los portaobjetos en la platina motorizada del microscopio y encienda el software estereológico preferido.
   2. Delinee el área de interés utilizando un objetivo de bajo aumento (2X o 4X) antes de cambiar a un objetivo de inmersión en aceite de 100X (consulte Figure 2A).
   3. Usando un punto específico de un marco de conteo (e.g., en una esquina o adyacente a ella), localice la parte superior de la sección desplazándose a lo largo del plano focal hasta que aparezca alguna característica de la sección enfocada. Registre esta posición z como 0 (consulte Figure 2B).
   4. Mueva el plano focal hacia abajo a través del tejido hasta que el mismo punto específico del marco de conteo esté en el último nivel z del tejido enfocado y marque esta posición. El grosor del tejido local se define desde 0 hasta este punto final y se puede leer en el eje z. Registre el grosor del tejido (consulte Figure 2B).
2. Documente la penetración completa de la tinción y la distribución de las células en todo el espesor de la sección.
   NOTA: La distribución de las neuronas marcadas con BrdU se utiliza como guía para determinar las zonas de protección necesarias. Aunque una distribución uniforme de las celdas es fundamental, es aceptable observar menos celdas cerca de la parte superior e inferior de la sección, lo que indica el efecto de las tapas perdidas.
   1. Muestree neuronas marcadas con BrdU y registre su posición z junto con el grosor de la sección local medido en la esquina seleccionada de cada marco de conteo.
   2. Grafique el número de neuronas BrdU positivas en función de su posición z.
3. La altura de las zonas de dirección y de guarda debe fijarse en función del grosor medio de la sección y de la distribución de las celdas (véanse 3.1 y 3.2).
   NOTE: La altura del disector debe ser menor que el grosor de la sección para evitar artefactos cerca de las superficies. Este riesgo se evita mediante la inclusión de zonas de protección en la parte superior e inferior de la sección.
4. Determine la longitud del paso entre los disectores.
   1. Delinea la región de interés en todas las secciones a analizar y registra las áreas.
   2. Suma estas áreas y divídelas por el número de disectores colocados dentro de esta área.
      NOTE: Sobre la base de la experiencia previa, un buen punto de partida implica 75 sondas. Esto aproximará el área y las posiciones de muestreo correspondientes (A_step).
   3. Toma la raíz cuadrada de A_step, que proporcionará el tamaño del paso x-y.
5. Determine el tamaño del marco de conteo.
   1. Establezca el tamaño del marco de conteo en una unidad arbitraria y realice un muestreo piloto de neuronas BrdU-positivas utilizando los parámetros obtenidos en las secciones 3.3 y 3.4.
      NOTE: El tamaño debe determinarse empíricamente por ensayo y error, pero se recomienda ajustarlo para permitir el muestreo de 2-3 células por disector.
6. Después de este paso final del estudio piloto, comience el muestreo de células.
   NOTA: Los parámetros de muestreo obtenidos deben dar como resultado recuentos de aproximadamente 150 a 200 células en cada animal, suficientes para obtener un diseño estereológico eficiente.
7. Cuente las neuronas BrdU positivas utilizando un objetivo de inmersión en aceite del 100× y un aumento final de 2000-3000×. En cada disector óptico, identifique las neuronas marcadas con BrdU que se reconozcan por la característica de interés (en el presente estudio, el criterio es cuándo el borde delantero de la neurona marcada con BrdU se enfoca por primera vez), se encuentran dentro del marco de conteo o tocan las líneas de inclusión (Figura 2B). No cuente las neuronas BrdU positivas que tocan las líneas de exclusión cuando se reconocen claramente por la característica de interés dentro de la altura del disector. Es de vital importancia seguir cuidadosamente estas reglas de conteo a lo largo de toda la cuantificación estereológica.
   NOTE: A medida que el BrdU se incorpora a todas las células en división, la morfología distingue entre neuronas y otros tipos de células. Las características de las neuronas son un núcleo claramente definido con un citoplasma neutro y un nucléolo oscuro. Las células BrdU positivas se reconocen como neuronas recién formadas en función de su mayor tamaño que las células gliales. En estudios de proliferación a corto plazo (p. ej., < 2,4 h), puede ser un requisito previo la tinción doble con marcadores neuronales inmaduros.

Results

Materials