Imágenes en vivo del ojo de la pupa de Drosophila mediante microscopía de fluorescencia

Resumen

Source: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)

El video muestra una técnica de imagen en vivo para estudiar el patrón de ojos en una pupa de Drosophila melanogaster. Los marcadores marcados con proteína fluorescente verde (GFP) permiten la visualización de la organización y diferenciación celular durante la formación de la estructura ocular en desarrollo.

Protocolo

1. Fluorescence Imaging

1. Imagen el Drosophila Preparación de la pupa mediante un microscopio fluorescente. Cada 7 min se capturan cortes seriados a través del dominio apical del neuroepitelio ocular, en la región de las uniones adherentes.
   NOTA: a) Las secciones en serie apropiadas suelen ser 4-5 por pila z, compuestas por pasos z de 0,2 μm. b) Las irregularidades en la topología del epitelio, incluidas protuberancias y pliegues leves, pueden dificultar la adquisición de imágenes enfocadas de grandes regiones de tejido. Al tomar imágenes, uno puede encontrar que parte de un área de interés está enfocada y una región vecina está desenfocada. La inclusión de una pequeña gota de agua destilada entre el ojo de la pupa y el cubreobjetos puede eliminar algunos pliegues agudos del tejido, pero no la topología ligeramente desigual característica de las primeras etapas de la morfogénesis del ojo de la pupa. En estos casos, sobremuestree el tejido extendiendo la pila z hasta que se adquieran cortes enfocados para todo el campo. c) La captura de secciones seriadas cada 7 minutos debe permitir la obtención de imágenes en vivo durante 3 a 4 horas sin una reducción significativa en la intensidad de la fluorescencia de la proteína fluorescente verde (GFP) que pueda comprometer la calidad de la imagen. Los intervalos de tiempo más cortos pueden reducir el tiempo total de obtención de imágenes.
2. Continúe con la toma de imágenes durante 3 a 4 horas. No utilice una función automática de enfoque y tiempo que está disponible en muchos microscopios fluorescentes, ya que el crecimiento de la pupa y el bombeo de la hemolinfa mueven la posición de la retina y se requiere un reenfoque atento cada 14-21 minutos.

NOTE: Las imágenes más allá de las 4 horas pueden retrasar o detener la morfogénesis del ojo.

3. Utilice el software de deconvolución adecuado para reducir el fondo y mejorar el contraste de las imágenes de la sección en serie. Para cada archivo z-stack, realice lo siguiente en el software de fluorescencia avanzada (LAS AF) de Leica Application Suite: Vaya al panel Herramientas, seleccione Deconvolución 3D y haga clic en Aplicar.
4. Generar una imagen de proyección máxima (MP) para cada archivo de pila deconvoneado: Vaya al panel Herramientas, seleccione Proyección 3D y haga clic en Aplicar.
   NOTA: Es posible que el algoritmo MP no logre generar una imagen uniformemente enfocada para el tejido que ha sido sobremuestreado.

2. Procesamiento de imágenes

1. Alineación automática de la imagen:

NOTA: The live Drosophila tejido se moverá y crecerá a lo largo del proceso de imagen. En consecuencia, los centros de las imágenes reunidas en puntos de tiempo sucesivos pueden no corresponder al mismo punto en el Drosophila tejido. Además, todo el disco de la retina gira unos 30° entre ~21 y 23 horas después de la formación del pupario (APF). Para resaltar los comportamientos individuales de las células y reducir las distracciones causadas por el crecimiento de los organismos, alinee cada imagen MP. Si bien esto se puede realizar manualmente, el software de edición de imágenes utilizado aquí tiene algoritmos incorporados que pueden acelerar el proceso.

2. Desde la pestaña Archivo del menú principal, abra Scripts y seleccione Cargar archivos en la pila.
3. Importe los archivos de imagen MP en el panel Cargar capas y seleccione Aceptar. Asegúrese de que la opción Intentar alinear imágenes de origen no esté seleccionada automáticamente.
4. NOTE: Si se selecciona esta opción, el software puede utilizar un algoritmo de alineación que distorsiona los datos de la imagen.
5. Una vez que todos los archivos MP se hayan cargado en el panel Capas, asegúrese de que todas las imágenes estén en orden cronológico, de modo que el punto de tiempo más antiguo esté en la parte superior de la pila de capas. Si las capas no están en el orden correcto, arrástrelas y suéltelas hasta que estén ordenadas correctamente.
6. Seleccione Alinear capas automáticamente en la pestaña Editar del menú principal. Elija Reposicionar y haga clic en Aceptar.
7. Si el algoritmo de alineación automática no logra orientar los fotogramas a un punto focal relevante, realice pequeños ajustes con la herramienta Mover.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b
UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b
25 x 75 x 1 mm portaobjetos de microscopio de vidrio	Fisher Scientific	12-550-413
22 x 40 mm cubreobjetos de vidrio	VWR	48393-172
Pinzas	Fine Science Tools	91150-20
Whatman Papel de cromatografía de 3 mm	Fisher Scientific	05-713-336
Vaselina	Fisher Scientific	19-086-291
30 ml jeringa	Fisher Scientific	S7510-30
Adobe Photoshop CS5	Adobe
Leica TCS SP5 DM microscopio	Leica Microsystems
LAS AF Versión 2.6.0.7266 software de microscopio	Leica Microsystems