Imágenes longitudinales de dos fotones de neuronas marcadas con fluorescencia en un hipocampo de ratón vivo

Resumen

Fuente: Ulivi, A. F., et. al. Imagen longitudinal de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra imágenes longitudinales de dos fotones de neuronas piramidales marcadas fluorescentemente en un ratón vivo, mostrando la preparación, la alineación de las cánulas y la obtención de imágenes de dendritas y espinas dendríticas para estudiar la estructura neuronal en la región CA1 del hipocampo.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de la sesión de imágenes
2. Encienda la configuración de imágenes con anticipación y deje que el láser se caliente y estabilice, si es necesario.
3. Anestesia al ratón. Coloque el ratón en la cámara de inducción de anestesia a un 3% de isoflurano en 1 L/min de O₂ y espere hasta que pierda el conocimiento. Evalúe la anestesia mediante la prueba de reflejo de pellizco de los dedos del pie.
4. Utilice pinzas para retirar con cuidado la película adhesiva de la placa de soporte de la cabeza. Sostenga el mouse con la mano y la placa de soporte de la cabeza con los dedos. Retire la película con suavidad para evitar dañar la preparación.
5. Coloque el ratón bajo el microscopio, sobre la alfombra calefactora, y asegure la placa de la cabeza al soporte (Figura 1D).
6. Coloque el cono de la nariz para cubrir el hocico y disminuya el isoflurano al 1,5-2%.
7. Aplica ungüento oftálmico en los ojos del ratón.
8. Limpie la cánula de imágenes enjuagándola con agua desionizada. Use una jeringa y una aguja delgada para dejar caer agua en la cánula y una bomba de vacío para extraerla.

2. Sesión de imágenes

1. Utilice objetivos de bajo aumento y larga distancia de trabajo para verificar visualmente la cánula en busca de agua residual, suciedad, integridad y presencia de fluorescencia.
2. Alinee la cánula con el eje óptico ajustando los ángulos de los brazos del soporte de la cabeza.
3. Cambie a los objetivos de inmersión en agua 25X 1.0 NA (apertura numérica), 4 mm WD (distancia de trabajo) o 40X 0.8 NA, 3 mm WD. Agregue suficiente agua desionizada para llenar la cánula y mantener el exceso de agua en la parte superior de la cánula. Evite la formación de burbujas de aire.
4. Utilice excitación de dos fotones (2P) e imágenes fluorescentes.
   NOTA: El protocolo de imágenes depende en gran medida de las escalas temporales y espaciales que se van a fotografiar. Consulte los resultados representativos y la discusión de la sección para obtener detalles sobre la configuración de imágenes que hemos utilizado para producir las imágenes que se muestran en este artículo.

Resultados

Materiales