Imágenes longitudinales de dos fotones de neuronas marcadas con fluorescencia en un hipocampo de ratón vivo

Resumen

Fuente: Ulivi, A. F., et. al. Imagen longitudinal de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra imágenes longitudinales de dos fotones de neuronas piramidales marcadas fluorescentemente en un ratón vivo, mostrando la preparación, la alineación de las cánulas y la obtención de imágenes de dendritas y espinas dendríticas para estudiar la estructura neuronal en la región CA1 del hipocampo.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de la sesión de imágenes
2. Encienda la configuración de imágenes con anticipación y deje que el láser se caliente y estabilice, si es necesario.
3. Anestesia al ratón. Coloque el ratón en la cámara de inducción de anestesia a un 3% de isoflurano en 1 L/min de O₂ y espere hasta que pierda el conocimiento. Evalúe la anestesia mediante la prueba de reflejo de pellizco de los dedos del pie.
4. Utilice pinzas para retirar con cuidado la película adhesiva de la placa de soporte de la cabeza. Sostenga el mouse con la mano y la placa de soporte de la cabeza con los dedos. Retire la película con suavidad para evitar dañar la preparación.
5. Coloque el ratón bajo el microscopio, sobre la alfombra calefactora, y asegure la placa de la cabeza al soporte (Figura 1D).
6. Coloque el cono de la nariz para cubrir el hocico y disminuya el isoflurano al 1,5-2%.
7. Aplica ungüento oftálmico en los ojos del ratón.
8. Limpie la cánula de imágenes enjuagándola con agua desionizada. Use una jeringa y una aguja delgada para dejar caer agua en la cánula y una bomba de vacío para extraerla.

2. Sesión de imágenes

1. Utilice objetivos de bajo aumento y larga distancia de trabajo para verificar visualmente la cánula en busca de agua residual, suciedad, integridad y presencia de fluorescencia.
2. Alinee la cánula con el eje óptico ajustando los ángulos de los brazos del soporte de la cabeza.
3. Cambie a los objetivos de inmersión en agua 25X 1.0 NA (apertura numérica), 4 mm WD (distancia de trabajo) o 40X 0.8 NA, 3 mm WD. Agregue suficiente agua desionizada para llenar la cánula y mantener el exceso de agua en la parte superior de la cánula. Evite la formación de burbujas de aire.
4. Utilice excitación de dos fotones (2P) e imágenes fluorescentes.
   NOTA: El protocolo de imágenes depende en gran medida de las escalas temporales y espaciales que se van a fotografiar. Consulte los resultados representativos y la discusión de la sección para obtener detalles sobre la configuración de imágenes que hemos utilizado para producir las imágenes que se muestran en este artículo.

Resultados

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de acero inoxidable Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm	Sawade	R00303	Tubo de acero inoxidable para el anillo metálico de la cánula
Microscope Cover glass (4 mm round)	Engelbrecht Medizin and Labortechnik		Cubreobjetos de vidrio para la cánula glass
Isofluran CP, Flasche 250 ml	Henry Schein VET GmbH	798932	Liquid isoflurano para anestesia
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer	Harvard Apparatus GmbH	34-1040	Vaporizador de isoflurano
Lab Active Scavenger	Gropper Medizintechnik	UV17014	Isoflurano sistema de carroñero
CMA 450 Temperature Controller	Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH	8003770	Manta térmica
Bepanthen Augen- und Nasensalbe	Bayer AG		Ophtalmic ointment
Head plates	Custom made		30 mm x 10 mm size; agujero de 8 mm de diámetro, titanio
Head plate clamp	Hecho a medida		Head plate holder
Soportes de postes de pedestal	Thorlabs	PH20E/M	Soporte de placa de cabeza
Publicación de acero inoxidable	Thorlabs	TR30/M	Soporte de placa de cabeza
Publicación de acero inoxidable	Thorlabs	TR75/M	Soporte de placa de cabeza
Publicación de acero inoxidable	Thorlabs	TR150/M	Soporte de placa de cabeza
Abrazaderas de conector de poste	Custom made		Soporte de la placa
Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps	Thorlabs	MB3045/M	Microscope stage
7" x 4" Lab Jack	Thorlabs	L490/M	Microscope stage
Low profile mask small rate	Emka Technologies	VetFlo-0801	Anesthesia face mask holder
Power Meter Model 1918-R	Newport		Medidor de potencia
X-Cite 120Q	Excelitas Technologies		Fluorescence lamp lamp
Microscopio de dos fotones	Bruker	Ultima IV	Microscopios de dos fotones
Microscopio de dos fotones	Thorlabs	Bergamo	Microscopios de dos fotones
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22	Olympus		Objetivos
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22	Olympus		Objectives
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5	Olympus		Objetivos
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18	Olympus		Objectives
Ultafast tunable laser for 2P excitation	Spectraphysics	Mai Tai Deep See	Excitaiton lasers
Ultafast láser sintonizable para excitación 2P	Spectraphysics	InSight DS+ Dual beam	Excitaiton lasers
Ultafast tunable laser for 3P excitation	Coherent	Monaco	Excitaiton Láseres

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