Investigación de los orígenes de las neuronas sensoriales en la duramadre mediante microscopía de fluorescencia

Resumen

Fuente: Wang, J., et al. Visualización de la inervación inmunorreactiva del péptido relacionado con el gen de la calcitonina de la duramadre craneal de la rata con inmunofluorescencia y rastreo neuronal. J. Vis. Exp. (2021).

Este video muestra un método para rastrear los orígenes de las neuronas sensoriales en la duramadre utilizando microscopía de fluorescencia. Se introduce un trazador retrógrado en la duramadre expuesta de una rata anestesiada. El trazador es absorbido por los axones neuronales sensoriales y viaja retrógradamente a sus cuerpos celulares dentro del ganglio del trigémino y los ganglios de la raíz dorsal cervical. A continuación, se seccionan los ganglios, se tiñen con anticuerpos que marcan el trazador y los neuropéptidos en los cuerpos celulares y se analizan mediante microscopía de fluorescencia para confirmar los orígenes ganglionares de las neuronas sensoriales.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Estudio de trazado retrógrado con fluororo (FG)

1. Procedimientos quirúrgicos
   1. Determine el área de coordenadas de interés en la duramadre craneal de rata.
   2. Prepare una microjeringa de 10 μL y pruébela con parafina líquida.
   3. Anestesiar las ratas con solución de tribromoetanol (150 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal. Verifique la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie.
   4. Afeita la cabeza de la rata con una maquinilla de afeitar eléctrica.
   5. Coloque barras romas en los oídos de la rata y colóquelas en el dispositivo estereotáxico. A continuación, coloque el soporte bucal y aplique una pomada oftálmica en los ojos.
   6. Limpie el sitio quirúrgico de la piel de la cabeza con yodo de povidona al 10% seguido de etanol al 75%.
   7. Haz una incisión a lo largo de la línea media del cuero cabelludo.
   8. Retire sin rodeos el periostio y los tejidos musculares del cráneo con aplicadores estériles con punta de algodón (Figura 1A).
   9. Taladre un pequeño agujero (~5-7 mm) con un fresador de fresas con una broca de punta redonda (#106) en los huesos parietal y temporal izquierdos por encima de la arteria meníngea media (MMA), y asegúrese de que la duramadre craneal se haya mantenido intacta (Figura 1B).
   10. Construya un banco alrededor del orificio con cemento de silicato dental para limitar la propagación del trazador (Figura 1C).
   11. Agregue 2 μL de FG al 2% en el orificio alrededor de MMA con una microjeringa de 10 μL (Figura 1D).
   12. Cubra el orificio con un pequeño trozo de esponja hemostática.
   13. Coloque un trozo de película de parafina en el orificio y selle los bordes con cera ósea para evitar la fuga de trazador y evitar contaminar los tejidos circundantes.
   14. Suturar la herida con hilo estéril.
   15. Mantén a las ratas en un área cálida hasta que se hayan recuperado por completo.
   16. Regrese las ratas a sus jaulas y agregue un antibiótico y un analgésico al agua potable.
2. Perfusiones y secciones
   1. Después de 7 días de supervivencia, perfunde estas ratas.
   2. Diseccionar el ganglio del trigémino (TG) y los ganglios de la raíz dorsal C1-4 (DRG), luego posfijarlos y crioprotegerlos (Figura 1F).
   3. Corte el TG y los DRG con un grosor de 30 μm en un sistema de micrótomo criostato en la dirección sagital y montado en portaobjetos de vidrio recubiertos de silano.
3. Inmunofluorescencias dobles para el marcaje de péptidos relacionados con el gen FG y la calcitonina (CGRP) en los TG y DRGs
   NOTA: Aunque el marcaje de FG se puede observar directamente con iluminación ultravioleta (UV) bajo lámpara de mercurio sin tinción adicional, las neuronas marcadas con FG se examinaron más a fondo en TG y DRG cervicales utilizando inmunofluorescencias dobles con FG y CGRP para revelar los orígenes de las fibras nerviosas inmunorreactivas de CGRP durales en los TG y DRGs.
   1. Encierre las secciones en un círculo con la pluma histoquímica.
   2. Incubar las secciones durante 30 min en una solución de bloqueo que contenga un 3% de suero de burro normal y un 0,5% de Triton X-100 en tampón de fosfato (PB) 0,1 M.
   3. Transfiera las muestras a la solución de anticuerpo anti-fluorogold de conejo (1:1000) y anti-CGRP de ratón (1:1000) en 0,1 M PB que contenga 1% de suero de burro normal y 0,5% de Triton X-100 durante la noche a 4 °C.
   4. Lave las secciones tres veces en 0.1 M PB al día siguiente.
   5. Incubar en una solución mixta de anticuerpo secundario anti-conejo de burro Alexa Fluor 594 (1:500) y anti-ratón de burro Alexa Fluor 488 (1:500) en 0,1 M de PB que contiene un 1% de suero de burro normal y un 0,5% de Triton X-100 durante 1,5 h a temperatura ambiente.
   6. Lave y aplique cubreobjetos a las secciones.
4. Observación y registro
   1. Tome imágenes de las neuronas marcadas con FG en TG y DRG bajo iluminación UV con un microscopio fluorescente equipado con una cámara digital.
   2. Capture imágenes de las neuronas marcadas con FG y CGRP en TG y DRG bajo un microscopio fluorescente equipado con una cámara digital.
   3. Utilice el software de edición para ajustar el brillo y el contraste de las imágenes y para agregar etiquetas en las imágenes.

Resultados

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A21202	Proteger de la luz; RRID: AB_141607
Brain stereotaxis instrument	Narishige	SR-50
CellSens Dimension	Olympus	Version 1.1	Software of fluorescent microscope
Fluorogold (FG)	Fluorochrome	52-9400	Protect from light
Fluorescent imaging system	Olympus	BX53
Freezing microtomo	Thermo<
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Mouse anti-CGRP	Abcam	ab81887	RRID: AB_1658411
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin 568	Molecular Probes	A12380	Protect from light
Photoshop and Illustration	Adobe	CS6	Photo editing software
Rabbit anti-Fluorogold	Abcam	ab153	RRID: AB_90738
Sprague Dawley	Institutos Nacionales para el Control de Alimentos y Medicamentos	SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus microscope slides	Thermo<	25x75x1mm

td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Microm InternationalGmbHtd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>#4951PLUS-001