Monitorización de la recuperación de células interneuromasto ablacionadas con láser en pez cebra mediante microscopía confocal

Resumen

Fuente: Volpe, B. A., et al. Ensayo de ablación y regeneración láser basado en microscopio confocal en células interneuromast de pez cebra. J. Vis. Exp.{{TAG_ 31}} (2020)

Este video demuestra el monitoreo de la recuperación de los interneuromastocitos en el pez cebra utilizando microscopía confocal, rastreando la muerte celular y la reparación a través de imágenes de fluorescencia de lapso de tiempo.

Protocolo

1. Imágenes posteriores a la ablación y microscopía de lapso de tiempo para estudiar la regeneración

1. Haga clic en el menú desplegable para "Canales". En los canales, desmarque la pista "DAPI"(4′,6-diamidino-2-fenilindol) para desactivar el láser de ablación. Haga clic en el menú desplegable para "Modo de adquisición".
2. En el modo de adquisición, haga clic en "Zoom".
3. Disminuya el zoom a 0.7 usando el control deslizante o escribiendo "0.7."
   1. Para garantizar el éxito de la ablación celular, aumente la ganancia a 900 y escanee rápidamente el campo de visión.
      NOTA: No debe haber GFP (proteína fluorescente verde) dentro de la célula o células objetivo. Utilizando los mismos ajustes o ajustes similares a los descritos para las imágenes previas a la ablación, capture y guarde una imagen posterior a la ablación (Figura 1C). Si la imagen revela restos de células fluorescentes o cuerpos celulares adicionales que deben eliminarse, repita los pasos de la ablación con láser para crear un espacio visible en la cadena de células interneuromasto.
   2. Inspeccione la imagen del canal T-PMT (tubo fotomultiplicador de transmisión) para confirmar aún más el daño celular. Las células dañadas tendrán una apariencia granular, y los núcleos se hincharán con frecuencia o se volverán irregulares en forma (Figura 2).
4. Después de capturar una imagen previa a la ablación, ablacionar las células según sea necesario y capturar una imagen posterior a la ablación para cada posición individual de la etapa, configure la microscopía de lapso de tiempo activando las opciones de posición de la etapa y tiempo para la captura de imágenes. Establezca los parámetros de tiempo en 24 h u otro punto final deseado e intervalos de 15 minutos. Inicie el experimento para adquirir imágenes y guarde el archivo resultante cuando esté completo (al día siguiente).
5. Si las larvas van a ser estudiadas o criadas más a fondo, retírelas cuidadosamente de la agarosa con pinzas finas, luego transfiéralas a un medio E3 sin tricaína para su recuperación. Si no se van a utilizar más, se practica la eutanasia de acuerdo con el protocolo animal aprobado (la inmersión rápida y sostenida en un baño de hielo es un método común) y se desechan según lo requiera la institución.

Resultados

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
12-well PTFE Printed Slides	Electrónica Microscopy Sciences	63425-05
15 mM Tricaine stock solution	Sigma	E10521	15 mM Tricaine in reverse osmosis water
1X E3 + 600 μM Tricaine			Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media
1X E3 media	<	Dilute 60X E3 media a 1X en agua de ósmosis inversa (16.7 ml/L)
60 X E3 media	Todos los componentes comprados a Sigma-Aldrich		34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 en agua de ósmosis inversa de 1 litro
Bx60 Microscopio compuesto con fluorescencia de lámpara de arco de mercurio	Olympus
Microscopio confocal LSM 700 equipado con láseres de 405 nm, 488 nm y 555 o 561 nm	Carl Zeiss Microscopy, LLC<	Se utilizó un láser de 5 mW y 405 nm para la ablación; Las ablaciones y las imágenes se realizaron a través de un objetivo Plan-Apochromat de 63x con una NA de 1.40
FIJI/ImageJ Software de procesamiento de imágenes	Múltiples contribuyentes		Descargable en https://fiji.sc/
Aguja de disección modificada en cuchillo para el cabello	Fisher Scientific	19010	Una pestaña estaba pegada en el extremo de una aguja de disección con mango de madera
Microsoft Excel software	Microsoft Corp.		Google sheets es una alternativa sin costo a Microsoft Excel
Platos de 35 mm con fondo de cristal con cubreobjetos n.º 1.5, ventana	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	35 mm placa de Petri, ventana de vidrio de 20 mm
Immersol 518F Immersion Oil	Fisher Scientific	12-624-66A
Low Gelling Agarose	Sigma Life Science	A9414-256
Inserto Corning Netwell con malla de poliéster de 74 mmm, inserto de 24 mm	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Rstudio software	Rstudio PBC		Descargable en https://rstudio.com/
Microscopio estereoscópico SMX-168-BL	Motic
Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-711-7M
ZEN software	Carl Zeiss Microscopy, LLC<

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