Imágenes de calcio de las actividades de las neuronas entéricas y la glía en un plexo mientérico colónico de ratón

Resumen

Fuente: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca²⁺ Imágenes del sistema nervioso entérico. J. Vis. Exp. (2015)

Este video muestra el calcio imágenes para visualizar y analizar la actividad de las neuronas entéricas y la glía en preparaciones de plexo mientérico colónico de ratón.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por la revisión ética animal apropiada

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1.Prepare Búfer de Krebs modificado.

Haga un búfer de Krebs modificado de tal manera que las concentraciones finales (en mM) de los componentes sean las siguientes: 121 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl₂, 1.2 MgCl₂, 1.2 NaH₂PO₄, 10 HEPES, 21.2 NaHCO₃, 1 ácido pirúvico y 8 glucosa (pH ajustado a 7,4 con NaOH). Añade 3 μM de nicardipina y 1 μM de escopolamina para inhibir las contracciones musculares durante el Ca²⁺ imágenes y disecciones de montaje completo.

2. Imágenes y análisis

NOTA: Utilice al menos un equipo de imagen básico con una fuente de luz fluorescente, un microscopio, una cámara CCD de calidad y un software de adquisición adecuado. Varíe la adición de otros componentes en función de la fuente de luz y la aplicación específica. Se debe utilizar una rueda de filtros y un obturador con una fuente de luz de arco de xenón tradicional. Sin embargo, las fuentes de luz LED y los sistemas de iluminación no requieren esos componentes.

1. Coloque la cámara de registro bajo el microscopio y, utilizando un sistema de perfusión de flujo por gravedad con múltiples depósitos de jeringa calentados, establezca una tasa de perfusión continua de 2–3 ml/min de tampón Krebs de 37 °C. Asegúrese de evitar la formación de burbujas de aire tanto en la línea de entrada como en la de succión conectada a una trampa de vacío.
2. Enfocar el plexo deseado bajo una iluminación de campo brillante. Evite la sobreexposición del tejido, ya que puede provocar un fotoblanqueo.
3. Examine la carga de Fluo-4 dentro de los ganglios y seleccione ganglios sanos para la toma de imágenes. Los ganglios enfermos/dañados exhibirán autofluorescencia o morfología punteada y no deben usarse para la toma de imágenes.
4. Una vez seleccionado el ganglio, desvíe la trayectoria de la luz a la cámara y obtenga una imagen en vivo con el software de adquisición de imágenes. Asegúrese de que el ganglio esté enfocado y establezca la velocidad de adquisición de imágenes y los tiempos de exposición.
   NOTA: Las tasas y tiempos de adquisición de imágenes variarán dependiendo de los eventos que los investigadores deseen registrar. Para la mayoría de los experimentos, las imágenes se adquieren tradicionalmente a 0,5-1 Hz para las células gliales y hasta 2-10 Hz para las neuronas porque las gliales Ca²⁺ respuestas no son tan rápidas como Ca²⁺ transitorios en las neuronas.
5. Comience el experimento y establezca la actividad de referencia durante 30 segundos.
6. Aplique fármacos precalentados de interés, como agonistas y antagonistas de los receptores, utilizando el sistema de perfusión de flujo por gravedad a una velocidad de 2-3 ml/min. Después de la aplicación de agonistas/antagonistas, vuelva a una perfusión de tampón normal y espere un período de lavado/recuperación de al menos 10 minutos.
   NOTE: Los tiempos de aplicación del fármaco variarán en función del compuesto individual y del diseño experimental. En general, una aplicación de 20-30 segundos de agonista es suficiente para activar los receptores acoplados a proteínas G en las neuronas y las células gliales. Sin embargo, los canales iónicos activados por ligando (como los receptores nicotínicos de acetilcolina) requieren tiempos de aplicación de no más de 5-10 segundos. Las exposiciones de mayor duración harán que los canales iónicos activados por ligandos se desensibilizen rápidamente. Los antagonistas deben aplicarse durante aproximadamente 3-15 minutos para asegurar el bloqueo completo de las vías receptoras. Sin embargo, esta es una generalización burda y los investigadores siempre deben optimizar cualquier medicamento experimental en su paradigma particular.
7. Detenga la grabación y vea la película de lapso de tiempo del experimento. Seleccione cuidadosamente las regiones de interés (ROI) utilizando el software de análisis de imágenes adecuado.
8. Utilice software para normalizar y comparar la intensidad fluorescente del ROI con su valor fluorescente de referencia inicial. Los cambios en la fluorescencia normalizada son directamente proporcionales a los cambios en [Ca²⁺].
   1. Utilice una modificación de un método descrito anteriormente utilizando ΔF/F = ((F1− F0)/F0)ROI − ((F1− F0)/F0)background, donde F1 es la fluorescencia en cualquier punto dado y F0 es la fluorescencia de referencia, para mejorar la precisión de la evaluación. Esta modificación ayuda a reducir el ruido de los cambios de fluorescencia en las preparaciones tisulares que exhiben movimiento de la capa muscular subyacente al plexo mientérico.

Materiales