$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Llenado de astrocitos con iontoforesis
- Pruebe el electrodo.
- Coloque una rodaja de cerebro suavemente en un plato con fondo de vidrio lleno de 0,1 M PBS a temperatura ambiente. Sostenga la rebanada en su lugar con un arpa de platino con cuerdas de nailon.
- Asegúrese de que el electrodo esté conectado a una fuente de voltaje y coloque el electrodo de tierra en el baño que contiene el corte de cerebro.
- Mueve el objetivo a la región del cerebro que te interese.
- Baje el electrodo en la solución. Bajo el campo brillante, muévalo al centro del campo de visión y examínelo cuidadosamente con la lente de inmersión en agua de 40x para asegurarse de que parezca claro y sin residuos ni burbujas. Si hay algo que obstruye la punta del electrodo, reemplácela por una nueva.
NOTA: La obstrucción es un problema para el electrodo de 200 MΩ. Con la centrifugación y filtración de la solución de tinte antes de cada experimento, esto no debería ser un problema frecuente. Sin embargo, debido a que la punta del electrodo es pequeña, a veces el tejido puede atascarse en la abertura. Los autores no han encontrado una manera de prevenir esto, pero se puede tratar fácilmente simplemente usando un nuevo electrodo. - Bajo el campo brillante, baje lentamente el electrodo hacia el corte deteniéndose justo por encima de la superficie.
- Llene el astrocito con iontoforesis.
- Identifique los astrocitos a 40-50 μm por debajo de la superficie del corte con el contraste de interferencia diferencial infrarrojo (IR-DIC). Busque células con somata alargado de forma ovalada de aproximadamente 10 μm de diámetro. Una vez que se elige un astrocito, muévalo al centro del campo de visión.
NOTA: Una buena célula para la iontoforesis tiene bordes claros y definidos a su alrededor. No elija celdas demasiado cerca de la superficie de la rebanada porque no se pueden llenar por completo. Se necesita algo de práctica durante unos días para poder identificar de forma rutinaria los astrocitos para el relleno de tinte. Dependiendo del área del cerebro utilizada para el experimento, el número de astrocitos puede variar. Esto puede afectar el tiempo necesario para identificar un astrocito antes de llenarlo. - Baje lentamente la punta del electrodo en la rebanada, navegando a través del tejido, hasta que esté en el mismo plano que el cuerpo de la célula.
NOTA: Mueva el electrodo lentamente para evitar dañar el tejido. - Una vez que el cuerpo celular del astrocito esté claramente visible y delineado, avance lenta y suavemente el electrodo hacia adelante. Mueva el electrodo hasta que la punta empale el soma de la célula. Mueva el foco del objetivo lentamente hacia arriba y hacia abajo para notar si el electrodo está dentro del soma.
NOTA: La punta del electrodo debe estar dentro del cuerpo de la célula, y se debe observar una pequeña hendidura en el soma. No mueva más el electrodo para evitar que la punta atraviese la celda. - Una vez que la punta del electrodo esté dentro de la celda, encienda el estimulador a ~ 0.5-1 V y expulse corriente continuamente a la celda. Con el microscopio confocal, observe cómo se llenan las células. Aumente el zoom digital para ver los detalles de la célula y asegúrese de que la punta del electrodo sea visible dentro de la célula.
NOTA: Baje el voltaje si parece que el tinte se está escapando de la celda o llenando otras celdas en las cercanías. Si parece que el tinte todavía se está escapando de la celda, extraiga el electrodo lentamente y busque otra celda. Es importante que el tinte no se filtre para tener una alta relación señal/fondo en la imagen final. - Espere unos 15 minutos hasta que las ramas y los procesos más finos aparezcan definidos, apague el voltaje y retire suavemente la punta del electrodo de la celda.
- Visualice la celda llena.
NOTA: Las imágenes se pueden realizar inmediatamente después del llenado. Un objetivo con una apertura numérica (NA) más alta da como resultado una mejor resolución. - Espere hasta que la célula vuelva a su forma original antes de obtener imágenes (15-20 min) con un objetivo de 40x. Para obtener una imagen de la celda, ajuste la configuración en el confocal para asegurarse de que las ramas y los procesos más finos aparezcan definidos.
- Configure una pila z con un tamaño de paso de 0,3 μm. Mientras toma la imagen, mueva el objetivo hasta que no haya señal de la celda y configúrelo como la parte superior. Luego, mueva el objetivo hacia abajo (enfocándose a través de la celda) hasta que no haya señal, configúrelo como la parte inferior.