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1. Enchapado de las células
NOTA: Según la experiencia, se recolectan alrededor de 100,000 células viables por embrión. Las ratas embarazadas cronometradas de 2 a 3 meses de edad suelen tener camadas de 8 a 10 embriones; por lo tanto, una estimación aproximada del rendimiento total de células por ratón preñada cronometrada es de aproximadamente 1 millón de células.
- Usando un hemocitómetro, realice un recuento de células y luego diluya la suspensión a 2,000 células/μL usando medio de cultivo celular. Triturar brevemente para mezclar.
- Retire los cubreobjetos con solución de laminina de la incubadora y aspire la solución de laminina restante de los cubreobjetos recubiertos con una aspiradora. Coloque rápidamente para evitar que los cubreobjetos se sequen por completo. Pipetear 100 μL (2,0 x 105 células/cubreobjetos) en cada cubreobjetos y colocar placas de Petri en una incubadora a 37 °C durante 1 h.
- Agregue con cuidado 3 mL de medio de cultivo celular a cada plato y vuelva a colocarlo en la incubadora a 37 °C. Preforma medio cambia 2 veces por semana durante 2 semanas.
2. Infección de cultivo celular a los 14 (días in vitro) DIV con vectores
- virales adenoasociados (AAV)Para cada plato prepare 1 mL de medio DMEM libre de suero con 1 μL de hSyn-GCaMP6f AAV (1.0 x 1013 titro)
- Aspire el medio de cultivo celular de cada placa y reemplácelo con 1 mL de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) libre de suero que contenga hSyn-GCaMP6f. Vuelva a colocar los platos en la incubadora a 37 °C durante 1 h.
- Aspire el medio libre de suero que contiene AAV y reemplácelo con 3 mL de medio de cultivo celular. Vuelva a colocar los platos en la incubadora a 37 °C. Hemos encontrado que 5-7 días de infección por AAV permiten niveles ideales de expresión de GCaMP. Continúe cambiando de medio cada 2-3 días durante este período de infección viral.
3. Imágenes confocales de Ca2+ en vivo entre 19-21 días in vitro (DIV)
NOTA: Las imágenes se pueden realizar entre 5-7 días después de la infección viral. Esta es la ventana ideal para lograr una expresión visible del fluoróforo a niveles que permitan la detección de la actividad espontánea de Ca2+.
- Preparación de búferes de grabación
- Para hacer 1 L de tampón de grabación HEPES, añada: 9.009 g de NaCl, 0.3728 g de KCl, 0.901 g de D-glucosa, 2.381 g de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES), 2 mL de solución madre de CaCl2 1 M y 500 μL de solución madre de 1 M MgCl2 a 800 mL de H2 destilado estérilO. Lleve el pH a 7.4 con NaOH. Llevar a un volumen final de 1 L.
- Para hacer 200 mL de tampón de registro de glutamato de 20 μM, diluya 40 μL de solución madre de glutamato de 100 mM en 200 mL del tampón de registro HEPES descrito anteriormente.
- Confocal imaging
- Llene una placa de Petri estéril de 35 mm con 3 mL de tampón de grabación.
- Retire una placa de Petri de 35 mm con cultivos infectados de la incubadora a 37 °C. Con pinzas de punta fina, agarre con cuidado el borde de un cubreobjetos y transfiéralo rápidamente a la placa de Petri llena de tampón de grabación. Vuelva a colocar el cubreobjetos restante en el medio en la incubadora a 37 °C. Transporte la placa con el tampón de registro al microscopio confocal.
- Inicie el software de imagen. Continúe con el siguiente paso mientras se inicializa.
- Inicie la bomba peristáltica y coloque la línea en el búfer de grabación. Calibra la velocidad del flujo para que sea de 2 mL/min.
- Transfiera el cubreobjetos infectado de la placa de Petri de 35 mm al baño de grabación.
- Usando el objetivo de inmersión en agua 10x y la luz de campo claro (BF), encuentre el plano de enfoque y busque una región con una alta densidad de cuerpos de células neuronales. Cambie al objetivo de inmersión en agua de 40x y utilice la luz BF para reenfocar la muestra.
- En la ventana "Lista de tintes" dentro de FluoView, seleccione AlexaFluor 488 y aplíquelo.
- Las expresiones de AAV pueden ser variables; por lo tanto, para evitar la sobreexposición y el fotoblanqueo de los fluoróforos, comience con ajustes bajos de HV y potencia láser. Para el canal AlexaFluor 488, establezca el alto voltaje (HV) en 500, la ganancia en 1x y el desplazamiento en 0. Para la línea láser 488, ajuste la potencia al 5%. Para aumentar el volumen efectivo visualizado en el plano z, aumente el tamaño del agujero de alfiler a 300 μm. Utilice la opción de escaneo "focus x2" para ajustar de forma óptima las señales de emisión a niveles de subsaturación. A partir de aquí, la configuración se puede ajustar hasta lograr la visibilidad ideal de cada canal.
NOTA: Para capturar con precisión la gama completa de flujos de Ca2+ con GCaMP, ajuste la configuración de potencia de HV y láser de referencia para permitir un aumento en la intensidad fluorescente sin sobresaturar el detector. - Una vez optimizados los ajustes del microscopio, mueva la platina para localizar una región con múltiples células que muestren cambios espontáneos en la fluorescencia y enfoque de GCaMP6f al plano deseado para la obtención de imágenes.
- Utilice la herramienta "Recortar recto" para recortar el fotograma de la imagen a un tamaño que pueda alcanzar un intervalo de fotogramas de poco menos de 1 segundo. Esto es necesario para establecer el intervalo de imagen en 1 fotograma por segundo.
- Establece la ventana "Intervalo" en un valor de 1.0 y la ventana "Num" en 600.
NOTA: Para entregar diferentes búferes de grabación en el punto de tiempo deseado (300 s), es importante calibrar la latencia de la bomba para entregar la nueva solución al baño. Esto dependerá de la velocidad de perfusión de la solución (2 mL/min) y de la longitud de la línea utilizada para bombear la solución. - Para capturar una película de la serie t, seleccione la opción "Tiempo" y luego use la opción de escaneo "XYt" para comenzar a tomar imágenes.
- Observe la barra de progreso de la imagen y mueva la línea del búfer de registro HEPES al búfer de registro de glutamato de 20 μM en el punto de tiempo apropiado (por ejemplo, si la latencia de la bomba está calibrada para administrar solución a 60 s, mueva la línea al tampón de glutamato a 240 fotogramas para administrar glutamato a 300 s).
- Cuando se complete la imagen, seleccione el botón Series Done y guarde la película t-series terminada. Continúe perfundiendo 20 μM de glutamato durante 5 minutos adicionales, de modo que las neuronas cultivadas hayan estado expuestas al glutamato durante un total de 10 minutos. Repita este proceso para cada cubreobjetos que se vaya a fotografiar.
- Después de la exposición adicional de 5 minutos a 20 μM de glutamato, retire el cubreobjetos del baño y vuelva a colocarlo en la placa de Petri de 35mm que contiene el tampón de grabación hasta que se complete el día de la imagen.