Este video demuestra el uso de imágenes de fluorescencia para medir los niveles de calcio citosólico en cultivos de hipocampo de ratas a corto y largo plazo. Al comparar neuronas jóvenes y envejecidas, destaca cómo el aumento de la densidad del canal de calcio dependiente de voltaje de tipo L y la activación prolongada en las neuronas envejecidas dan como resultado una sobrecarga de calcio, un sello distintivo del envejecimiento neuronal. Los indicadores fluorescentes de calcio revelan estas diferencias a través de cambios en la intensidad de la fluorescencia tras la estimulación.
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Artículo de método
Imágenes de calcio in vitro en cultivos de hipocampo de rata a corto y largo plazo
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29 de mayo de 2025
En este artículo
Resumen
Protocolo
1. Cultivo a corto y largo plazo de las neuronas del hipocampo de rata
- Preparación de cubreobjetos de vidrio de 12 mm recubiertos de poli-D-lisina.
- Esteriliza cubreobjetos de vidrio de 12 mm de diámetro en etanol durante al menos 24 horas. Déjalos secar en condiciones estériles.
- Distribuya los cubreobjetos en una tira de parafilm en una placa de Petri. Cubra la superficie de cada cubreobjetos con 200 μl de poli-D-lisina de 1 mg/ml. Permitir el tratamiento durante la noche (O/N).
- Al día siguiente, lave los cubreobjetos con agua estéril bidestilada cada 15 minutos durante 90 minutos en condiciones estériles.
- Llene una placa multiplato de cuatro pocillos con 500 μl de medio de cultivo neurobasal por pocillo. El medio de cultivo neurobasal debe complementarse con un 10% de suero fetal bovino, un 2 % de B27, 1 μg/ml de gentamicina y 2 mM de L-glutamina.
- Coloque los cubreobjetos en el plato multiplato. Manténgalos en un ambiente humidificado a 37 ºC y 5% 2 incubadora hasta su uso.
- Aislamiento de neuronas del hipocampo de ratas neonatas.
- Prepare 1,8 ml de solución de papaína (comprada directamente) en un vial (20 μl/ml) en condiciones estériles: Para obtener una concentración final de 20 μl/ml, añada alrededor de 40 μl de papaína en 1,8 ml de Hank's más un 0,6% de albúmina sérica bovina (BSA, μl debe calcularse dependiendo de las condiciones del proveedor). Hank's 0,6% BSA se prepara mezclando 85 ml de Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) con 15 ml de albúmina sérica bovina al 4% (BSA, preparada disolviendo 4 g de BSA en 100 ml de HBSS). Prepáralo en una capucha estéril.
- Incubar la papaína en Hank's plus 0,6% BSA durante 30 min a 37 ºC antes de su uso. Filtre la solución con un filtro de 0,22 μm antes de usarla.
- Prepare el medio F-12 de Ham añadiendo el medio de águila modificado de Dulbecco en polvo (13,5 g por L) en 900 ml de agua estéril bidestilada. A continuación, añade 6 g de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) y 336 mg de NaHCO3 y ajuste el pH a 7,42 con NaOH 4 N. Agregue agua estéril para obtener una solución de 1 L y fíltrela con un filtro de tapa de botella de polietersulfona (PES) de 0,20 μm. Lleve este proceso en una capucha estéril. Finalmente, sature la solución con CO2 en condiciones estériles antes de su uso. Almacenar las soluciones a 4 ºC y utilizarlas refrigeradas.
- Eutanasia a las crías de rata recién nacidas (P0) por decapitación y lavar la cabeza en medio HBS estéril. Abre el cráneo con la ayuda de unas tijeras estériles. Extraiga el cerebro con una espátula y lávelo rápidamente en el medio F-12 de Ham.
- Haz un corte diagonal con la ayuda de un bisturí en cada hemisferio (Figure 1B) y llévelo a una placa de Petri que contenga el medio F-12 de Ham.
- Deseche las meninges cuidadosamente con la ayuda de pinzas de disección y bajo una lupa.
- Identifique el hipocampo en una ubicación cóncava característica sobre la corteza utilizando una lupa. Luego, separa el hipocampo de la corteza tirando con cuidado de un borde y retirándolo de su posición con unas tijeras para los ojos.
- Transfiera el tejido del hipocampo a una placa de 4 pocillos llena de medio de Hank estéril que carece de Ca2+ and Mg2+ más 0.6% BSA y lavar el tejido del hipocampo. Sin quitar el medio, corte el tejido en trozos pequeños (alrededor de 2 x 2 mm) con las mismas tijeras de ojo.
- Transfiera los trozos de hipocampo a un vial que contenga 1,8 ml de solución de papaína prefiltrada. A continuación, incubarlas a 37 ºC con agitaciones ocasionales y suaves. 15 min después, añadir 90 μl de solución de DNasa I (50 μg/ml final) e incubar durante 15 min más.
- Transfiera el tejido a un tubo de centrífuga de 10 ml y lave los fragmentos con medio de cultivo Neurobasal fresco. Obtener la suspensión celular pasando fragmentos de tejido a través de una pipeta de plástico de 5 ml.
- Suspensión de la célula centrífuga a 160 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante con una pipeta Pasteur estéril de plástico y suspenda el pellet con cuidado con una pipeta automática de 1 ml en 1 ml de medio de cultivo neurobasal.
- Mida la densidad celular utilizando una cámara de recuento de Neubauer. Coloque el cubreobjetos de vidrio sobre la cámara Neubauer. Añadir 10 μl de suspensión celular. Asegúrese de que la suspensión de la celda ingrese a la cámara de manera uniforme y no haga burbujas. Cuente el número de células bajo el microscopio y realice los cálculos correspondientes para obtener una caída adecuada de 40-80 μl que contenga 30 x 103 cells. El número total de celdas dependerá del número de animales utilizados.
- Cultivo a corto y largo plazo de neuronas del hipocampo de rata.
- Sobre la placa multiplato de cuatro pocillos que contiene 500 μl de Medio de Cultivo Neurobasal preparado antes y guardado en la incubadora, placa de alrededor de 30 x 103 células en una gota de unos 50 μl a cada pocillo de la placa multiplato que contiene un cubreobjetos de vidrio de 12 mm de diámetro recubierto de poli-D-lisina.
- Mantener las células primarias del hipocampo en un ambiente humidificado de 37 ºC y 5% . style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>2incubadora durante 2-5 días in vitro (DIV, a corto plazo, cultivos jóvenes) o >15 DIV (A largo plazo, cultivos envejecidos) antes de experimentos sin cambiar los medios de cultivo.
2. Imágenes de fluorescencia del Ca citosólico2+ Concentration
- Preparación de soluciones de prueba para imágenes de fluorescencia.
- Prepare una solución salina externa tamponada con HEPES (HBS) que contenga, en mM: NaCl 145, KCl 5, MgClnúmero arábigo 1, CaCl2 1, glucosa 10, sodio-HEPES 10 (pH 7.42).
- Prepare un estilo externo, Mg2+2 1, glucose 10 y HEPES 10 (pH 7.42).
- Resolver N-Metil-D-aspartato (NMDA) en Mg2+ solución salina tamponada con HEPES (HBS) a una concentración final de 100 μM y suplementarla con 10 μM de glicina.
- Prepare una solución HBS que contenga KCl en lugar de NaCl resolviendo (en mM): KCl 145, MgCl2 1, CaCl2 1, glucosa 10 y HEPES 10 (pH 7.42).
- Carga de células del hipocampo con sonda de calcio fluorescente fura2/AM.
- Retire el cultivo celular que contiene cubreobjetos de la incubadora y lávelos con medio HBS a temperatura ambiente (RT) transfiriéndolos a una nueva placa multiplato de cuatro pocillos que contenga 500 μl de HBS por pocillo.
- Incubar células con fura2/AM 4 μM (preparadas en el mismo medio HBS) durante 60 min a RT (25 ºC) en un lugar oscuro.
- Después de 60 minutos, lave las fundas con medio HBS fresco.
- Grabación de imágenes de fluorescencia citosólica [Ca2+] en células cultivadas.
- Encienda la lámpara, el microscopio, el sistema de perfusión, la cámara de fluorescencia y el ordenador.
- Coloque los cubreobjetos en una plataforma termostatizada para cubreobjetos de vidrio abiertos de 12 mm en la platina del microscopio invertido y seleccione un campo microscópico utilizando un objetivo 40X (aceite, apertura numérica [NA]:1.3). Perfundir las células de forma continua con medio HBS precalentado (37 ºC) en ausencia o presencia de sustancias problema. Mantenga el flujo a una velocidad de aproximadamente 5-10 ml/min.
Note: sistema de perfusión celular para células vivas está montado en una plataforma termostatizada para cubreobjetos de vidrio abiertos de 12 mm. El sistema de perfusión impulsado por gravedad de 8 líneas equipado con un controlador de válvulas se utiliza para perfundir las soluciones. Una bomba de vacío se encarga de eliminar cualquier exceso de medio. Las soluciones se calientan mediante un sistema de calentamiento en tubo. - Capture una imagen de fondo con el obturador cerrado en ambas longitudes de onda de excitación.
- Epi-ilumina las células alternativamente a 340 y 380 nm. Registre la luz emitida a 520 nm cada 5-10 segundos con una cámara de fluorescencia, que es filtrada por un espejo dicroico fura-2.
- Una vez finalizado el período de grabación, almacene la secuencia completa de imágenes emitidas a 520 nm en el ordenador para su posterior análisis.
- Análisis de imágenes fluorescentes grabadas.
- Abre el archivo del experimento. Con el software aquacosmos, haga clic en 'Ratio' y seleccione el rango de ratio deseado. Calcule la relación píxel por píxel en las imágenes resultantes para obtener una secuencia de imágenes de proporción.
- Reste el fondo ajustando la 'eliminación de fondo'. Pulse 'iniciar cálculo'.
- Presione el botón 'secuencia de todos los tiempos' y borre las regiones antiguas de interés (ROI). Para el análisis cuantitativo de células individuales, establezca nuevas regiones de interés o ROI correspondientes a neuronas individuales. Promedie todos los valores de relación en cada píxel correspondiente a cada ROI y cada imagen para obtener un registro de los valores de fluorescencia de la relación para ROI individuales (celdas).
- Para graficar las grabaciones individuales, exporte los valores de fluorescencia correspondientes a cada ROI a un programa de gráficos.
- Realice los cálculos correspondientes para estimar el tamaño de los aumentos en la relación fluorescencia en respuesta a cada estimulación utilizando un software adecuado de análisis de datos y gráficos.
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Resultados
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Neurobasal Culture Medium | |||
| HBSS medium | |||
| Ham's F-12 medium< | |||
| DNase I (from bovine pancreas) | |||
| Fetal Bobine Serum | |||
| B27 | |||
| Gentamicin | |||
| L-glutamine | |||
| 12 mm glass coverslips< | |||
| Papain | |||
| 4-well placas multidish | |||
| Petri plates | |||
| Sterile pipeettes | |||
| Fura2-AM | |||
| Lipofectamine2000 | |||
| NMDA | |||
| Glycine | |||
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | |||
| Xcite lighting system | |||
| ORCA ER fluorescence camera< | |||
| VC-8 valve controller | |||
| SH-27B heating sistema | |||
| Aquacosmos Software |
