Obtención de imágenes de las placas de beta amiloide en secciones de tejido cerebral mediante inmunomarcaje y tinción de curcumina

Resumen

Fuente: Maiti, P. et. al.,. Marcaje e imagen de las placas amiloides en el tejido cerebral utilizando el polifenol natural curcumina. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra el procedimiento de imagen de las placas de beta amiloide en secciones de tejido cerebral utilizando inmunomarcaje y tinción de curcumina. El inmunomarcaje proporciona especificidad para la beta-amiloide, mientras que la curcumina se une selectivamente a las fibrillas ricas en β láminas, lo que mejora la visualización. La colocalización de la fluorescencia roja y verde confirma la presencia de placas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y el veterinario JoVE <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>                                                                  

1. Perfusión de los animales

1. Prepare el fijador y los tampones de perfusión.
   1. Prepare un tampón de fosfato de sodio de 0.1 M agregando 80 g de cloruro de sodio (NaCl), 2 g de cloruro de potasio (KCl), 21.7 g de fosfato de hidrógeno disódico (Na₂HPO₄·7H₂O), 2.59 g of potassium dihydrogen phosphate (KH₂PO₄), y agua destilada doble para hacer un total de 1 L.
   2. Prepare paraformaldehído (PFA) al 4%.
      1. Añade 40 g de paraformaldehído a 1 L de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (0,1 M, pH 7,4).
      2. Calentar la solución de PFA a 60-65 °C y mezclar con un agitador magnético.
         NOTA: The la temperatura no debe superar los 65 °C.
      3. Agregue unas gotas de hidróxido de sodio (NaOH) (1 N) con un gotero para disolver completamente el PFA.
      4. Filtre la solución de PFA con papel de filtro medio a fino y almacene a 4 °C.
         NOTA: The La solución es válida durante un mes.
2. Realizar anestesia y perfusión animal.
   NOTE: Twelve-month-old B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J ( 5x enfermedad de Alzheimer familiar (5×FAD)) se compraron a los vendedores y se criaron en la casa de animales de la Universidad Estatal de Saginaw Valley. El genotipado se confirmó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Human Alzheimer's disease (AD) el tejido cerebral incluye tejido cerebral postmortem AD y tejido de control adaptado a la edad.
   1. Anestesiar al animal con un agente anestésico adecuado, como pentobarbital sódico (390 mg/kg de peso corporal), o una mezcla de ketamina/xilacina (hasta 80 mg/kg de ketamina de peso corporal y 10 mg/kg de xilacina de peso corporal) mediante inyección intraperitoneal (aguja de 27 G y jeringa de 1 mL). Verifique el nivel de anestesia pellizcando un dedo del pie. Si el animal no responde, entonces está listo para la cirugía de perfusión.
   2. Colocar el animal anestesiado en decúbito supino sobre la bandeja de cirugía de perfusión y, con unas tijeras pequeñas para el iris, realizar una incisión en el extremo posterior del ventrículo izquierdo.
   3. Inserte una aguja de perfusión de 22 g en el ventrículo izquierdo y haga una pequeña incisión en la aurícula derecha para extraer el líquido de perfusión del cuerpo. Utilice un sistema de perfusión alimentado por gravedad para permitir que el fluido de perfusión helado (0,1 M PBS, pH 7,4) fluya durante 5-6 min (caudal 20-25 ml/min).
      NOTE: A clear El hígado es el indicador de la perfusión óptima.
   4. Cambie la válvula amortiguadora a una solución helada de paraformaldehído al 4% para su fijación y déjela fluir durante 8-10 minutos.
      NOTE: temblor seguido de extremidades endurecidas o rígidas es un indicador de buena fijación.
   5. Extraer el cerebro del cráneo con unas tijeras. Con una espátula, recoja el cerebro y colóquelo en un vial de PFA al 4% (al menos 10 veces el volumen del cerebro) y guárdelo a 4 °C hasta su uso posterior.

2. Tissue processing

1. Cortar secciones de criostato.
   1. Transfiera el cerebro a soluciones de sacarosa graduadas (10%, 20% y 30%) y almacene a 4 °C durante 24 h cada una, hasta su uso.
   2. Con un criostato a -22 °C, corte secciones de 40 μm de grosor. Recoja de 10 a 20 secciones por pocillo en una placa de 6 pocillos llena de PBS y azida de sodio (0.02%).

3. Colocalize cur(curcumin) con el Aβ anticuerpo en placas y oligómeros de Aβ.

1. Lave las secciones de criostato del paso 2.1.2 con PBS 3x en una placa de 12 pocillos.
2. Bloquear las secciones con un 10% de suero de cabra normal (NGS) disuelto en PBS con Triton-X-100 al 0,5% a temperatura ambiente durante 1 h.
3. Deseche la solución de bloqueo. Incubar las secciones con anticuerpos específicos de beta amiloide (Aβ) (6E10 o A11, diluidos 1:200) disueltos en una solución de bloqueo fresca que contenga un 10% de NGS y un 0,5% de Triton-X100 durante la noche a 4 °C en un agitador a 150 rpm.
4. Deseche la solución de anticuerpos y lave las secciones con PBS 3x durante 10 minutos cada una.
5. Incubar con la etiqueta de anticuerpo secundario con fluoróforo rojo (por ejemplo, Alexa
6. 594) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
7. Lavar con PBS 3 veces durante 10 minutos cada una.
8. Lavar con alcohol al 70% 1x.
9. Incubar las secciones con curcumina (Cur (10 μM)) durante 5 min a temperatura ambiente.
10. Lavar con alcohol al 70% 3 veces durante 1 minuto cada una.
11. Deshidratar con 90% y 100% de alcohol durante 1 min cada uno, borrar con xileno 2x durante 5 min cada uno, y montar en diapositivas usando distyrene plastizer xylene (DPX).
12. Visualice utilizando un microscopio de fluorescencia con filtros de excitación/emisión apropiados para las señales roja y verde.

Materiales