Visualización de la actividad de la proteína quinasa A en un ratón mediante microscopía de imágenes de fluorescencia de dos fotones

Abstract

Fuente: Jongbloets, B. C., et al. Visualización de la actividad de la proteína quinasa A en ratones que se comportan con cabeza fija utilizando microscopía de imágenes de por vida de fluorescencia de dos fotones in vivo. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra un procedimiento de microscopía de imágenes de fluorescencia de dos fotones para visualizar la actividad de la proteína quinasa A en ratones que se comportan con la cabeza fija durante la locomoción forzada.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. En vivo Microscopía de imágenes de por vida de fluorescencia de dos fotones

1. Comience la obtención de imágenes de por vida con fluorescencia de dos fotones (2pFLIM) a las 2 semanas o más después de la instalación de la ventana craneal. Minimice la interferencia experimental debida al estrés por la manipulación frecuente y el desaliño del ratón antes del inicio del estudio de imagen para habituar al ratón.
2. Establezca la longitud de onda del láser de excitación de dos fotones en 960 nm utilizando el software que controla el láser de dos fotones.
3. Anestesiar al ratón con isoflurano al 4%. Confirme la anestesia adecuada mediante un pellizco de cola y observando la frecuencia respiratoria. Es decir, no debe haber respuesta al pellizco de la cola y la frecuencia respiratoria debe reducirse a ~ 1 respiración por segundo. Para minimizar el tiempo innecesario del procedimiento y debido a que la anestesia dura solo dos o tres minutos, no se utilizan lubricantes oculares.
4. Transfiera el ratón anestesiado a la cinta de correr motorizada (Figura 1C) y monte la placa de cabecera del ratón en el soporte de la placa de la configuración de la cinta de correr (ver Figura 1 para más detalles). Limpie la superficie de la cubierta de la ventana craneal del ratón con etanol al 70%.
5. Coloque la cinta de correr motorizada con el mouse montado debajo del objetivo 2pFLIM. Aplique una gota de agua destilada entre el cubreobjetos de la ventana craneal y el objetivo.
6. Deje que el ratón montado despierte de la anestesia y se aclimate al entorno de la cinta de correr y el microscopio durante al menos 10 minutos. Controle la frecuencia respiratoria del ratón mientras el ratón montado se despierta de la anestesia.
7. Navegue hasta el lugar de inyección bajo epiiluminación. Documente las características fiduciales (es decir, los vasos sanguíneos) bajo campo claro para ayudar a obtener imágenes de la misma región de interés (ROI) durante las sesiones de imágenes posteriores.
8. Elimina cualquier luz entrante que no sea la emitida por el tejido cerebral. Apague la fuente de luz de epiiluminación y cierre la carcasa del equipo 2pFLIM. Active el PMT 2pFLIM activando el control de voltaje del comando de hardware.
9. Adquiera una imagen z-stack de 2pFLIM utilizando el software de adquisición de 2pFLIM FLIMimage con los siguientes ajustes recomendados para obtener imágenes de somata tAKARα positivo en ratones despiertos. Establezca el promedio de fotogramas en 3 fotogramas, la velocidad de escaneo en 2 ms/línea, el tamaño de imagen en 128 x 128 píxeles y el campo de visión en 90−100 μm. Ajuste la configuración de imágenes en función de la preparación y la configuración del hardware.
10. Inspeccione la imagen adquirida en la vista FLIM (software personalizado desarrollado internamente). Ajuste la configuración de imagen siguiendo el paso 1.9 para optimizar el recuento de fotones y minimizar el fotoblanqueo.

NOTA: Un recuento de fotones integrado viable en un ROI para la obtención de imágenes de por vida de un soma tAKARα positivo in vivo es de ~1.000-10.000 fotones, dependiendo de la amplitud de la señal que resulte de un estímulo particular.

1. Utilice un campo de visión disminuido, una velocidad de escaneo disminuida, una mayor potencia láser y un mayor número de fotogramas que se promediarán para aumentar los recuentos de fotones integrados y reducir el error de estimación de la vida útil. Al mismo tiempo, asegúrese de utilizar la potencia láser mínima esencial, el promedio de fotogramas y la velocidad de escaneo para minimizar el fotoblanqueo.
2. Visualice la imagen en un intervalo de tiempo regular (por ejemplo, cada 30-60 s) repitiendo la adquisición de la pila z utilizando la configuración determinada en el paso 1.10. Adquiera imágenes de referencia de 2pFLIM durante al menos 15 minutos a velocidad cero en la cinta de correr.
3. Ajuste la velocidad de rotación de la cinta de correr a ~15 cm/s durante 15 minutos mientras adquiere imágenes 2pFLIM. Continúe con la toma de imágenes durante ≥20 minutos después de apagar la rotación de la cinta de correr, para evaluar la duración de la actividad de PKA después del cese de la locomoción forzada.
   

2. Análisis de imágenes 2pFLIM

1. Abra las imágenes adquiridas en FLIMview y establezca los siguientes parámetros en FLIMview.

1. Haga clic en los campos de rango mínimo y máximo de conteo de fotón único (SPC) en FLIMview. Introduzca el valor de rango SPC mínimo y máximo adecuado, que suele oscilar entre 1,2−2 y 10−12 ns, respectivamente.

2. Haga clic en el campo de valor t₀ en FLIMview e introduzca el valor t₀ (normalmente ~2 ns). Haga clic en el campo de valor de umbral mínimo de luminancia de vida útil en FLIMview e introduzca el valor de umbral deseado en 5-30 fotones.

2. Haga clic en el botón de nuevo grupo (N) y asigne un nombre al grupo de experimentos. Esto generará un grupo que combina los datos de cada imagen FLIM agregada.

3. Haga clic en el botón ROI en el módulo Roi Controls de FLIMview y dibuje un ROI alrededor de un soma tAKARα-positivo. Reduzca el rango de z-stack, moviendo el límite z inferior y superior en los controles deslizantes z-stack Control en FLIMview, para minimizar la contaminación de la señal que se origina en los fotones de fondo en otras profundidades z.

4. Haga clic en el botón + para agregar la imagen FLIM al grupo (paso 2.2). Haga clic en el botón Calc para calcular el tiempo medio de vida útil (LT, también llamado tiempo medio de emisión de fotones [MPET]), para el ROI y el error de estimación del tiempo útil (δτ).

5. Abra el siguiente archivo de la serie cronológica de imágenes 2pFLIM. Repita el paso 2.4. Asegúrese de ajustar la posición del ROI y el rango de pila z para medir el mismo soma tAKARα positivo a lo largo del tiempo, ya que puede haber desviación del tejido con el tiempo.

6. Seleccione el deltaMPET/MPET₀ en el menú desplegable del módulo Group Controls. Haga clic en el campo baseline# e introduzca los índices (por ejemplo, 1 2 3 4 5 para las primeras cinco imágenes del grupo creado en el paso 2.3). Esto definirá la(s) imagen(es) utilizada(s) para calcular la vida útil de la línea base (LT₀).

7. Haga clic en Plot para generar un gráfico que contenga la respuesta FLIM (ΔLT/LT₀) de tAKARα durante el experimento en los ROI definidos. Los cambios normalizados en la vida útil (ΔLT) de los ROI individuales por la vida útil de referencia correspondiente (LT₀) permiten comparar la actividad de PKA durante la locomoción a través de diferentes ROI.

Results

Materials