Visualización tridimensional de una infección por el virus de la rabia en tejido cerebral de ratón

Resumen

Fuente: Zaeck, L., L. , et al. Imágenes 3D de alta resolución de la infección por el virus de la rabia en tejido cerebral aclarado con solvente. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra el proceso de preparación y obtención de imágenes de tejido cerebral de ratón infectado con el virus de la rabia (RABV) para evaluar la progresión de la infección. Describe los pasos clave, incluida la tinción de tejidos con marcadores fluorescentes, la deshidratación, el aclarado y el montaje para la microscopía de escaneo láser confocal, que culmina en la generación de una representación tridimensional.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

Se utilizó material cerebral archivado infectado con RABV y fijado con paraformaldehído (PFA).

PRECAUCIÓN: Este protocolo utiliza diversas sustancias tóxicas y/o nocivas, incluyendo PFA, metanol (MeOH), peróxido de hidrógeno (H₂O₂), azida de sodio (NaN₃), tert-butanol (TBA), alcohol bencílico (BA), benzoato de bencilo (BB) y éter difenílico (DPE). El MeOH y el TBA son altamente inflamables. Evite la exposición usando el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes y protección para los ojos) y realizando experimentos con una campana extractora. Recoja los residuos por separado en contenedores apropiados y deséchelos de acuerdo con las regulaciones locales. El virus de la rabia está clasificado como un patógeno de nivel de bioseguridad (BSL)-2 y, por lo tanto, generalmente se puede manejar en condiciones de BSL-2. Algunas actividades, incluidos los procedimientos que pueden generar aerosoles, el trabajo con altas concentraciones de virus o el trabajo con nuevos lisavirus, pueden requerir la clasificación BSL-3. Se recomienda la profilaxis previa a la exposición para el personal de alto riesgo, incluidos los cuidadores de animales y los trabajadores de laboratorio. Consulte las regulaciones de las autoridades locales.

1. Fijación de tejido encefálico y seccionamiento

1. Fije muestras de cerebro en un volumen apropiado de 4% de PFA en solución salina tamponada con fosfato (PBS [pH 7.4]) durante al menos 48 h a 4 °C (con una relación aproximada de tejido a fijador de 1:10 [v/v]).
2. Lave las muestras de tejido 3 veces en PBS durante al menos 30 minutos en cada lavado y guárdelas en NaN al 0,02%₃/PBS a 4 °C hasta su uso.
3. Seccione el tejido en secciones de 1 mm de espesor con un vibratomo (velocidad de avance de la cuchilla: 0,3-0,5 mm/s, amplitud: 1 mm, grosor de la rebanada: 1.000 μm).
4. Para conservar la secuencia de corte correcta, almacene cada sección de tejido por separado en un pocillo de una placa de cultivo celular de pocillos múltiples. Añadir 0,02% NaN₃/PBS y almacenar las secciones de tejido a 4 °C hasta su uso.

2. Pretratamiento de muestras con metanol

NOTA: Realice todos los pasos de incubación con una oscilación suave y, si no se indica lo contrario, a temperatura ambiente. Proteja las muestras de la luz. El pretratamiento de la muestra cumple el propósito general de mejorar la difusión de anticuerpos y reducir la autofluorescencia tisular mediante la exposición a MeOH y H₂O₂, respectivamente.

1. Prepare soluciones de MeOH al 20% (v/v), al 40%, al 60% y al 80% en agua destilada. Por ejemplo, para un 20% de MeOH, agregue 10 mL de 100% de MeOH a 40 mL de agua destilada en un recipiente hermético apropiado y mezcle invirtiéndolo.
2. Transfiera las muestras a recipientes de tamaño razonable (por ejemplo, tubos de reacción de 5 mL). Tenga cuidado de utilizar materiales químicamente resistentes a los reactivos utilizados en este protocolo. Por ejemplo, tenga en cuenta que mientras que el polipropileno es adecuado, el poliestireno no lo es.
   NOTA: Las especificaciones de volumen en este protocolo se refieren a tubos de reacción de 5 mL. Si se utiliza un recipiente diferente, ajuste los volúmenes en consecuencia.
3. Incubar las muestras en 4 mL de cada concentración de la serie preparada de soluciones de MeOH en orden ascendente durante 1 h cada una.
4. Incubar las muestras 2 veces durante 1 h cada una en MeOH puro (100%).
5. Enfríe las muestras a 4 °C (por ejemplo, en un refrigerador apto para laboratorio).
6. Prepare la solución blanqueadora (5% H₂O₂ diluyendo un 30% de H₂O₂ solución madre a 1:6 en MeOH puro (100%) y enfriarlo a 4 °C.
7. Retire el MeOH 100% de las muestras refrigeradas y agregue 4 mL de solución blanqueadora preenfriada (5% H₂O₂ en MeOH). Incubar durante la noche a 4 °C.
8. Cambie la solución blanqueadora por 4 mL de MeOH al 80% e incube durante 1 h. Continúe usando la serie preparada de soluciones de MeOH en orden descendente durante 1 h cada una hasta que las muestras se hayan incubado durante 1 h en 4 mL de MeOH al 20%.
9. Lave las muestras 1 vez durante 1 h con 4 mL de PBS.

3. Inmunotinción

NOTA: Realice todos los pasos de incubación con una oscilación suave y, si no se indica lo contrario, a temperatura ambiente. Proteja las muestras de la luz. Para prevenir el crecimiento microbiano, agregue NaN₃ hasta una concentración final de 0.02% a las soluciones de esta sección. Las muestras de tejido se permeabilizan aún más mediante el tratamiento con detergentes no iónicos Triton X-100 y Tween 20. El suero normal se utiliza para bloquear la unión de anticuerpos inespecíficos. Se añaden glicina y heparina para reducir el fondo de inmunomarcaje.

1. Lave las muestras 2 veces durante 1 h cada una en 4 mL de Triton X-100/PBS al 0,2%.
2. Permeabilizar las muestras durante 2 días a 37 °C con 4 mL de Triton X-100/20% dimetilsulfóxido (DMSO)/0,3 M glicina/PBS.
3. Bloquear la unión inespecífica de anticuerpos incubando las muestras durante 2 días a 37 °C en 4 mL de Triton X-100 al 0,2 %/10 % DMSO/suero normal al 6 %/PBS.
   NOTA: Use suero normal de la misma especie en la que se crió el anticuerpo secundario para lograr resultados de bloqueo ideales.
4. Incubar las muestras en 2 mL de solución de anticuerpos primarios (3% de suero normal/5% de DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 con heparina] + anticuerpo/anticuerpos primarios) durante 5 días a 37 °C. Actualizar la solución de anticuerpos primarios después de 2,5 días.
   1. Para la PTwH, reconstituya la sal sódica de heparina en agua destilada para hacer una solución madre de 10 mg/mL (almacene esta solución, alícuota, a 4 °C). Añadir la solución madre al 0,2% de Tween 20/PBS hasta una concentración final de 10 μg/mL.
      NOTA: La elección de la dilución de anticuerpos correcta puede requerir optimización. En general, las concentraciones inmunohistoquímicas estándar son un buen punto de partida.
5. Lave las muestras durante 1 día en 4 ml de PTwH, intercambiando el tampón de lavado al menos 4 a 5 veces durante el día y dejando el lavado final durante la noche.
6. Incubar las muestras en 2 mL de solución de anticuerpos secundarios (3% de suero normal/PTwH + anticuerpo/anticuerpos secundarios) durante 5 días a 37 °C. Refresque la solución de anticuerpos secundarios después de 2,5 días.
   1. Diluir el anticuerpo/anticuerpos secundarios a 1:500 en la solución de anticuerpos secundarios (es decir, 4 μL en 2 mL).
7. Lave las muestras durante 1 día como se describe en el paso 3.5, dejando el lavado final durante la noche.

4. Tinción nuclear

NOTA: Realice todos los pasos de incubación con una oscilación suave y, si no se indica lo contrario, a temperatura ambiente. Proteja las muestras de la luz. Si no se requiere tinción nuclear o se requiere la longitud de onda de excitación/espectro de emisión del rojo tiazol (TO-PRO-3) para la excitación o detección de otro fluoróforo, omita este paso.

1. Diluir la tinción de ácido nucleico TO-PRO-3 a 1:1.000 en PTwH e incubar las muestras en 4 mL de solución de tinción nuclear durante 5 h.
2. Lave las muestras durante 1 día como se describe en el paso 3.5, dejando el lavado final durante la noche.
   NOTA: Después de los lavados, las muestras pueden almacenarse en PBS a 4 °C hasta la limpieza óptica.

5. Limpieza de tejidos

NOTA: Realice todos los pasos de incubación con una oscilación suave y, si no se indica lo contrario, a temperatura ambiente. Proteja las muestras de la luz. Las muestras de tejido se deshidratan en una serie graduada de soluciones de TBA. Dado que la inmunotinción requiere soluciones acuosas, todos los procedimientos de tinción deben finalizarse antes de la limpieza del tejido. La holgura óptica y la adaptación del índice de refracción se logran mediante un tratamiento con una mezcla de BA, BB y DPE. La solución aclarante se complementa con DL-α-tocoferol como antioxidante.

1. Prepare soluciones de TBA al 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% y 96% de TBA en agua destilada. Por ejemplo, para un 30% de TBA, agregue 15 mL de 100% de TBA a 35 mL de agua destilada en un recipiente hermético apropiado y mezcle invirtiendo.
   NOTA: El TBA tiene un punto de fusión de 25-26 °C; Por lo tanto, tiende a ser sólido a temperatura ambiente. Para preparar soluciones de TBA, caliente el frasco bien sellado a 37 °C en una incubadora o baño de agua.
2. Deshidratar las muestras con 4 mL de cada concentración de la serie preparada de soluciones de TBA en orden ascendente durante 2 h cada una. Deje el 96% de TBA toda la noche.
3. Deshidratar aún más las muestras en TBA puro (100%) durante 2 h.
4. Prepare la solución de limpieza BABB-D15.
   NOTA: BABB-D15 es una combinación de BA y BB (BABB) que se mezcla con DPE en una proporción de x:1, donde x se especifica en el nombre de la solución, En este caso 15.
   1. Para BABB, mezcle una parte de BA con dos partes de BB.
   2. Mezcle BABB y DPE en una proporción de 15:1.
   3. Añadir 0,4 % en volumen de DL-α-tocoferol (vitamina E).
      NOTA: Por ejemplo, para 20 mL de BABB-D15, mezcle 6,25 mL de BA con 12,5 mL de BB. Añadir 1,25 mL de DPE y complementar con 0,08 mL de DL-α-tocoferol.
5. Limpie las muestras en una solución aclarante hasta que estén ópticamente transparentes (2-6 h).
6. Las muestras pueden almacenarse a 4 °C en BABB-D15, protegidas de la luz, hasta el montaje y la obtención de imágenes.

6. Montaje de muestras

1. Usando una impresora 3D, imprima la cámara de imagen y la tapa (material: copoliéster [CPE], boquilla: 0,25 mm, altura de la capa: 0,06 mm, espesor de la pared: 0,88 mm, recuento de paredes: 4, relleno: 100%, sin estructura de soporte).
2. Ensamble la cámara de imágenes (Figura 1).
   1. Monta un cubreobjetos redondo (diámetro: 30 mm) en la cámara de imagen con caucho de silicona RTV-1 (vulcanizante a temperatura ambiente de un componente). Retire el exceso de caucho de silicona con un hisopo de algodón humedecido en agua y cure durante la noche.
   2. Monta un cubreobjetos redondo (diámetro: 22 mm) en la tapa con caucho de silicona RTV-1. Retire el exceso de caucho de silicona con un hisopo de algodón humedecido en agua y cure durante la noche.
3. Coloque la muestra en una cámara de imagen, agregue un pequeño volumen de BABB-D15 e inserte la tapa. Llene la cámara con BABB-D15 a través de la entrada, usando una aguja hipodérmica (27 G x 3/4 de pulgada [0,40 mm x 20 mm]).
4. Tape la entrada y selle la cámara de imágenes con caucho de silicona RTV-1. Cura toda la noche en la oscuridad.

7. Imagen y procesamiento de imágenes

1. Configure la adquisición de imágenes seleccionando las respectivas líneas láser para que coincidan con los fluoróforos utilizados. Ajuste los rangos de detección de cada detector para evitar la superposición de señales entre canales.
   NOTA: Los rangos de detección ejemplares para Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 y TO-PRO-3 son 500-550 nm, 590-620 nm y 645-700 nm, respectivamente.
2. Elija los parámetros de adquisición, defina el borde superior e inferior de la pila z y adquiera la pila de imágenes.
   NOTA: Los parámetros de adquisición ejemplares son un escaneo secuencial con un tamaño de píxel de 60-90 nm, un tamaño de paso z de 0,5 μm, un promedio de línea de 1, una velocidad de escaneo de 400 Hz y un tamaño de agujero de alfiler de 1 unidad Airy.
3. Procese la pila de imágenes utilizando un software de análisis de imágenes adecuado (por ejemplo, Fiji) para generar proyecciones en 3D o realizar análisis en profundidad.
   NOTA: Debido al gran tamaño de los archivos de imagen adquiridos, suele ser necesario el uso de una estación de trabajo.
   1. Abra el/los archivo(s) de adquisición o de imagen en Fiyi (File |{ {TAG_589}} Abrir | Seleccionar archivos).
      1. Si utiliza, por ejemplo, archivos RIF, seleccione o anule la selección de las opciones deseadas en la ventana de diálogo Bioformatos. Pila de vistas con Hyperstack. Aparte de eso, no son necesarias selecciones o marcas específicas. Presione OK.
      2. Si el archivo contiene varias pilas de imágenes, seleccione las que desea analizar y confirme pulsando OK.
   2. Realice la corrección de blanqueo dividiendo la imagen combinada en canales individuales (Image |{ {TAG_645}} Color | Herramienta Canales, luego selecciona Más | Canales divididos). Para cada canal, selecciona Corrección de blanqueo (Imagen | Ajusta | Corrección de lejía) y elige Relación simple (intensidad de fondo: 0.0).
      NOTA: En algunos casos, por ejemplo, cuando no hay un decaimiento lineal de la señal o la señal es demasiado débil en general, Relación simple puede fallar. Alternativamente, prueba Exponential Fit u omite la corrección de blanqueo.
   3. Ajusta el brillo y el contraste de cada canal usando los controles deslizantes (Image |{ {TAG_724}} Ajustar | Brillo | Contraste).
   4. Fusionar los canales (Imagen |{ {TAG_754}} Color | Fusionar canales), hacer un compuesto (Imagen | Color | Herramienta de canales, luego seleccione Más | Make Composite), y conviértalo a formato RGB (Imagen | Color | Canales Herramienta, luego seleccione Más | Convertir a RGB).
   5. Si es necesario, cambie el tamaño de la pila de imágenes para reducir el tiempo de cálculo y el tamaño del archivo (Imagen | Ajustar | Size, ambas opciones marcadas más interpolación bilineal).
   6. Generar una proyección 3D (Imagen | Stacks | Proyecto 3D). Elija Brightest Point como método de proyección y establezca el espaciado de corte para que coincida con el tamaño del paso z de la pila de imágenes adquirida. Para obtener la máxima calidad, establezca el incremento del ángulo de rotación en 1 y habilite la interpolación. Modifique la rotación total, los umbrales de transparencia y la opacidad según sea necesario.
   7. Si es necesario, reajuste el contraste y el brillo convirtiendo la proyección 3D de nuevo a formato de 8 bits (Imagen | Type | 8-bit). Utilice los controles deslizantes respectivos (Imagen | Ajuste | Brillo | Contraste) y reconvierta la pila de imágenes a formato RGB como se describe en el paso 7.3.4.
   8. Guarde la proyección 3D como . Archivo TIF (formato de archivo de imagen) y archivo .AVI (formato de archivo de video).

Resultados

Materiales