Visualización tridimensional de una infección por el virus de la rabia en tejido cerebral de ratón

Resumen

Fuente: Zaeck, L., L. , et al. Imágenes 3D de alta resolución de la infección por el virus de la rabia en tejido cerebral aclarado con solvente. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra el proceso de preparación y obtención de imágenes de tejido cerebral de ratón infectado con el virus de la rabia (RABV) para evaluar la progresión de la infección. Describe los pasos clave, incluida la tinción de tejidos con marcadores fluorescentes, la deshidratación, el aclarado y el montaje para la microscopía de escaneo láser confocal, que culmina en la generación de una representación tridimensional.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

Resultados

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reagents
Alcohol bencílico	Alfa Aesar	41218	Clearing reagent
Benzoyl benzoate	Sigma-Aldrich	BB6630-500ML	Clearing reagent
Dimethyl sulfoxide	Carl Roth	4720.2	Varios búferes
Diphenyl ether	Sigma-Aldrich	240834-100G	Clearing reagent
DL-α-Tocopherol	Alfa Aesar	A17039	Antioxidante
Donkey serum	Bio-Rad	C06SBZ	Reactivo de bloqueo
Glycine	Carl Roth	3908.2	Reducción de fondo
Goat serum	Merck	S26-100ML	Reactivo de bloqueo
Heparin sodium salt	Carl Roth	7692.1	Reducción de fondo
Solución de peróxido de hidrógeno (30 %)	Carl Roth	8070.2	Sample bleaching
Methanol	Carl Roth	4627.4	Sample pretreatment
Paraformaldehydehíde	Carl Roth	335.3	Polvo cristalino para hacer solución fijadora
Sodium azide	Carl Roth	K305.1	Prevención del crecimiento microbiano en soluciones stock
tert-Butanol	Alfa Aesar	33278	Deshidratación de muestras para la limpieza de tejidos
TO-PRO-3	Thermo Fisher	T3605	Tinción de ácido nucleico
Triton X-100	Carl Roth	3051.2	Detergente
Tween 20	AppliChem	A4974,0500	Detergente
Miscellaneous
5 mL tubos de reacción	Eppendorf	30119401	Sample tubes
Cubreobjetos, circular (diámetro: 22 mm)	Marienfeld	111620	Parte de la cámara de imágenes
Cubreobjetos, circular (diámetro: 30 mm)	Marienfeld	111700	Part of imaging chamber
Aguja hipodérmica (27 G x 3/4" [0,40 mm x 20 mm])	B. Braun	4657705	Filling of the imaging chamber with clear solution
RTV-1 silicone rubber	Wacker	Elastosil E43	Adhesivo para el montaje de la cámara de imagen
Ultimaker CPE 2.85 mm transparent	Ultimaker	8718836374869	Filamento de copoliéster para impresora 3D para imprimir partes de la cámara de imagen
Technical equipment and software
3D printer	Ultimaker	Ultimaker 2+	Impresión de la cámara de imágenes
Sistema automatizado de inmersión en agua	Leica	15640019	Bomba de agua controlada por software
Benchtop orbital shaker	Elmi	DOS-20M	Incubación de muestras a temperatura ambiente (~ 150 rpm)
Agitador orbital de sobremesa, calentado	New Brunswick Scientific	G24 Environmental Shaker	Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm)
Microscopio de barrido láser confocal	Leica	DMI 6000 TCS SP5	Confocal invertido microscopio para imágenes de muestra<
Fiji	NIH (ImageJ)	software de código abierto (v1.52h)	Paquete de procesamiento de imágenes basado en ImageJ
Objetivo de inmersión en agua a larga distancia de trabajo	Leica	15506360	HC PL APO 40x/ 1.10 W motCORR CS2
Vibratome	Leica	VT1200S	Sample slicing
Workstation	Dell	Precision 7920	CPU: Intel Xeon Gold 5118
			GPU: Nvidia Quadro P5000
			RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4
			SSD: 2 TB
Primary antibodies
Goat anti-RABV N	Friedrich-Loeffler-Institut		Suero policlonal monoespecífico anti-RABV N de cabra, generado por inmunización de cabras con nucleoproteína N
	<	Dilution: 1:400
Rabbit anti-GFAP	Dako	Z0334	Anticuerpo policlonal (RRID:AB_10013382)
			Dilution: 1:100
Rabbit anti-MAP2	Abcam	ab32454	Anticuerpo policlonal (RRID:AB_776174)
			Dilution: 1:250
Rabbit anti-RABV P 160-5	Friedrich-Loeffler-Institut		Suero policlonal monoespecífico anti-RABV P de conejo, generado por la inmunización de conejos con fosfoproteína P RABV expresada por baculovirus y purificada con His-tag (ver referencia 23: Orbanz et al., 2010)
			Dilution: 1:1,000
Secondary antibodies
Donkey anti-goat IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed
			Dilution: 1:500
Donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	dependiendo de conjugado fluorophore	Highly cross-absorbed
			Dilución: 1:500
Donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	dependiendo del fluoróforo conjugado	Highly cross-absorbed
			Dilución: 1:500
Goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	dependiendo del fluoróforo conjugado	Highly cross-absorbed
			Dilución: 1:500
Goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	dependiendo del fluoróforo conjugado	Highly cross-absorbed
			Dilución: 1:500

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