Uso de reflectometría espectral para determinar los diámetros de los axones mielinizados en un corte fijo de cerebro de ratón

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Calibración

1. Encienda el microscopio al menos 1 h antes de la obtención de imágenes para permitir la estabilización térmica de la fuente láser (consulte la tabla de materiales). A continuación, encienda el software para el escaneo espectral (consulte la Tabla de materiales) y haga clic en el botón Adquirir en la parte superior de la GUI (interfaz gráfica de usuario) (Figura 1a).
2. Encienda el obturador de software para el láser de luz blanca (WLL) y el tubo fotomultiplicador (PMT) (Figura 1a).
3. Seleccione el modo xyΛ en la lista desplegable en Modo de adquisición, luego el modo de entrada láser cambia automáticamente de Porcentaje constante a Potencia constante. Desmarque la casilla de verificación de Movimiento automático de SP. A continuación, establezca la ventana espectral del láser de entrada en 470-670 nm y el tamaño del paso espectral en 4 nm en Configuración de escaneo lambda de excitación λ (Figura 1b).
4. ESTABLEZCA el rango espectral de PMT en 450-690 nm haciendo doble clic o moviendo la barra de ajuste para el rango espectral (Figura 1c).
   Nota: Este rango espectral debe incluir el ancho de banda completo de la fuente de entrada.
5. Seleccione una lente de objetivo de inmersión en agua, adecuada con una apertura numérica alta (NA > 0.7) y asigne cualquier valor a PMT y potencia láser para activar la configuración de AOBS (Divisor de haz acústico-óptico) y el botón Live Scan. Cambie la ruta óptica comprobando la reflexión en la configuración de AOBS (Figura 1d).
6. Monte un espejo de referencia (ver Tabla de Materiales) en la platina del microscopio. La superficie del espejo debe estar orientada contra la lente del objetivo. Si no es fácil montar el espejo en la platina del microscopio, adhiera un espejo a una placa plana (e.g., vidrio deslizante).
7. Controle la platina del microscopio para alinear el plano focal con la superficie del espejo.
8. Ajuste la ganancia PMT y la potencia del láser, teniendo en cuenta el rango dinámico del detector, y luego cambie el modo de entrada del láser de Porcentaje constante a Potencia constante.
   Nota: Como es típico, se utiliza una ganancia PMT de 500 (V) y una potencia láser relativa del 0,1% a 570 nm.
9. Confirme en un modo de pseudocolor para comprobar que no hay saturación en todo el rango de longitudes de onda. Si se observa saturación, baje la potencia del láser (Figura 1a).
10. Ejecute la adquisición de Lambda Scan.
11. Retire el espejo del escenario y repita la misma adquisición sin una muestra para obtener la referencia oscura (es decir, , desplazamiento oscuro).
12. Guarde los datos en un formato TIF multiapilado.

2. SpeRe (Reflectometría espectral) Adquisición de imágenes

1. Coloque el tejido montado en la platina del microscopio. Para alinear aproximadamente el tejido con el plano focal de la lente del objetivo, utilice el modo de fluorescencia de campo amplio a través de un ocular.
2. Con el Live Scan activado, controle la platina del microscopio para alinear el plano focal con la región de interés en el tejido. Para evitar el ruido de fondo del cubreobjetos, seleccione la región objetivo de al menos 15 μm de profundidad en la interfaz vidrio-tejido.
3. Adquiera la pila de imágenes espectrales para la región de destino utilizando el mismo procedimiento que se describe en los pasos 1.1 a 1.10.
4. Guarde los datos para el tejido y el desplazamiento oscuro en un formato Multistacked TIF.
   Nota: El experimentador puede hacer una pausa en esta etapa.

3. Procesamiento y análisis de imágenes

1. Abra los datos espectrales (TIF multi-stacked) para el espejo de referencia y el tejido cerebral en ImageJ.
2. Seleccione las ROI (regiones de interés) para las pilas de imágenes abiertas: el área central para el espejo de referencia y el segmento de una fibra axónica para el tejido cerebral.
3. Adquiera los espectros brutos para los ROI seleccionados ejecutando Image → Stacks → Trazar perfil del eje Z en el menú ImageJ.
4. Abra los datos de desplazamiento oscuro, uno tomado para el espejo de referencia y el otro tomado para el tejido cerebral.
5. Adquiera los espectros de las compensaciones oscuras ejecutando Image → Stacks → Trazar perfil del eje Z en el menú ImageJ.
6. Guarde todos los espectros adquiridos utilizando las opciones Copiar y pegar.
   Nota: Para la obtención de imágenes SpeRe, se recomienda el uso del campo central de imágenes para minimizar las aberraciones ópticas fuera del eje. Las fibras axónicas pueden ser estructuralmente heterogéneas a lo largo de su longitud. Por lo tanto, se recomienda seleccionar el ROI en un segmento de axón pequeño, normalmente < 5 μm, para minimizar el artefacto de volumen parcial.

Figura 1: Configuración del software. (a) La interfaz gráfica de usuario (GUI). En la ventana principal, hay principalmente cinco subpaneles: configuración de imágenes, configuración láser, configuración óptica, configuración del detector y visor de imágenes. (b) El menú desplegable para seleccionar el modo de imagen. Para SpeRe (reflectometría espectral), se selecciona xyλ. (c) El panel para ajustar la ventana espectral del detector. (d) El panel para configurar el divisor de haz acústico-óptico (AOBS). La 'reflectancia' se selecciona para guiar la luz reflejada al detector.