Visualización de proyecciones de neuronas motoras y ramificación de axones mediante microscopía de fluorescencia de lámina de luz

Resumen

Source: <a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57546/visualization-of-motor-axon-navigation-and-quantification-of-axon-arborization-in-mouse-embryos-using-light-sheet-fluorescence-microscopy'>Liau, E. S. et al. Visualización de la navegación de axones motores y cuantificación de la arborización de axones en embriones de ratón mediante microscopía de fluorescencia de lámina de luz. J. Vis. Exp. (2018).

Este video demuestra el uso de la microscopía de fluorescencia de lámina de luz para obtener imágenes de las proyecciones de las neuronas motoras y la ramificación de los axones en Embriones de ratón transgénicos. Describe los pasos involucrados en la preparación de muestras, imágenes y reconstrucción 3D de la ramificación axonal para evaluar el crecimiento y la conectividad de las neuronas motoras.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM) (2–3 h)

1. Configuración de muestras
   1. Configure ópticas de iluminación 5X/0.1 y ópticas de detección 5X/0.16. Ensamble el portamuestras y el capilar de muestras (1,5 mm de diámetro interno, verde) y colóquelos en el microscopio.
      NOTA: Consulte el Manual de funcionamiento del microscopio para conocer los procedimientos detallados de configuración.
   2. Monte el embrión de la siguiente manera:
      1. Prepare la punta de la pipeta P200 cortando la parte superior para que se ajuste al diámetro del capilar y retire la parte puntiaguda (~ 3 mm) para la fijación de la muestra.
      2. Derrita el extremo romo de la punta de la pipeta con una llama pequeña.
      3. Apague la llama y adhiera rápidamente el embrión verticalmente al extremo derretido.
      4. Coloque la parte superior de la punta de la pipeta con el capilar de muestra.
   3. Deje que el tampón de la cámara se equilibre con el embrión durante 1 minuto para eliminar los residuos o las burbujas.
   4. Usando el software de imágenes, seleccione Ubicar capilar debajo de la pestaña Localice tab y ajuste los ejes x, y y z para colocar el capilar de muestra.
   5. Seleccione Localizar muestra y amplíe a 0.6X para enfocar el embrión. Gire el embrión para asegurarse de que el eje largo de la extremidad de la imagen se alinee con la trayectoria de luz de las dos fuentes de luz (Figura 1B).
2. Adquisición de imágenes
   1. En la pestaña Adquisición tab, defina los parámetros de la trayectoria de la luz, como los objetivos de detección, el filtro de bloqueo láser, el divisor de haz, las cámaras y los láseres.
      NOTA: En este experimento se utiliza el canal de proteína fluorescente verde (GFP) (longitud de onda de excitación: 488 nm; filtro de emisión: paso de banda (BP) 505 a 545 nm; divisor de haz: SPS LP 560).
   2. Marque la casilla de verificación de escaneo pivotante para la reducción de sombras.
   3. Defina la configuración de adquisición: profundidad de bits, 16 bits; zoom, 0,36-0,7X; Iluminación de un solo lado (izquierda/derecha) o iluminación de dos lados.
   4. Haga clic en Continuo y establezca la intensidad del láser, el tiempo de exposición, la potencia del láser y la posición de la hoja de luz para obtener imágenes más nítidas.
      NOTA: La potencia del láser se mantiene lo más baja posible para minimizar el fotodaño.
   5. Presione STOP para finalizar la adquisición de imágenes.
3. Adquisición multidimensional
   1. Defina la pila z moviendo la posición Z para la primera y la última imagen. Haga clic en Óptimo para establecer el número de corte.
   2. Haga clic en Iniciar experimento para adquirir la pila z seleccionada.
   3. Cuando esté hecho, guarde la imagen en formato .czi.
4. Procesamiento de imágenes (opcional)
   1. Proceda con Fusión de doble cara bajo el canal Procesamiento de hojas de luz si se aplica iluminación de doble cara. Procesamiento multivistaes necesario si se adquieren vistas múltiples para combinar imágenes desde varios ángulos.
   2. Cree una imagen 2D utilizando datos de los píxeles de mayor intensidad a lo largo del eje de proyección bajo el canal Proyección de intensidad máxima.
   3. En el canal Copy, haga clic en Subset para seleccionar subconjuntos de imágenes del conjunto original.

2. Cuantificación de la arborización de los axones (30 min para cada nervio individual)

1. Abra el archivo de imagen en el software de análisis de imágenes (de forma predeterminada, la imagen que contiene los datos XYZ se abre en modo Surpass y como una vista renderizada en 3D).
2. Ajuste el color, el brillo y el contraste de la imagen usando la ventana Ajuste de pantalla (Editar | Mostrar ajuste de pantalla) para detectar filamentos en función del contraste de intensidad local.
3. Haga clic en el icono Añadir nuevos filamentos y seleccione el algoritmo Autopath (sin bucle) en el menú desplegable.
4. Seleccione la región de interés (en este caso, el axón de segmentación de interés). Haga clic en Siguiente cuando termine.
5. Defina los puntos inicial y de inicialización asignando las mediciones de diámetro más grandes y más delgadas, que se pueden medir usando el modo Slice .
6. Asigne un punto de partida en el borde de la región de interés. Para lograr la adición o eliminación manual de puntos de partida, primero cambie el modo de puntero (Navegar | Seleccione) y luego Mayús + clic derecho en los puntos de interés.
7. Seleccione umbrales manuales para los puntos de siembra para asegurarse de que toda la arborización visible esté marcada. Cambiar el modo de puntero (Navegar | Seleccione ) y luego Mayús + clic izquierdo en los puntos de interés para agregar o eliminar manualmente puntos de semilla.
   NOTA: Es importante eliminar manualmente los ruidos de fondo y las señales de los nervios vecinos.
8. Marque la casilla Eliminar puntos de semilla alrededor de los puntos de partida.
9. Marque Eliminar segmentos desconectados para permitir la exclusión de puntos que están demasiado lejos y que pueden representar ruido de fondo. Indique la Longitud máxima del espacio en el siguiente paso para definir el límite superior de exclusión.
10. Ajuste el umbral para la sustracción de fondo, que utiliza un filtro gaussiano para estimar la intensidad de fondo de cada vóxel.
11. Establezca el umbral automático para el diámetro de la dendrita utilizando el algoritmo Área aproximada de la sección transversal.
12. Omita los pasos para el cálculo del lomo.
13. Termina el proceso y elige el estilo y color deseado.
14. Desmarque la casilla de volumen en Properties para ver solo los axones reconstruidos.
15. En la pestaña Estadísticas pestaña, seleccione Detallado. Utilice Filamento No. Puntos terminales de dendritas para cuantificar las terminales nerviosas motoras como indicador de la arborización de los axones motores.
    NOTA: Se puede agregar una anotación estadística si se desea.
16. Exporte la imagen del axón reconstruido como un archivo .tif.

Resultados

Materiales