Imágenes histoquímicas de módulos corticales en secciones cerebrales aplanadas

Resumen

Source: Lauer, S. M., et al. Visualización de módulos corticales en cortezas de mamíferos aplanadas. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra un método para visualizar los módulos corticales en secciones cerebrales aplanadas utilizando tinción histoquímica. Las secciones prefijadas se tratan con un reactivo de deformación que resalta los grupos neuronales activos, formando regiones oscuras de alto contraste. Después del montaje y la deshidratación, los módulos corticales aparecen bajo un microscopio de campo claro como patrones oscuros e irregulares.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Visualización de módulos corticales mediante tinción de citocromo oxidasa

NOTA: Se han desarrollado diferentes protocolos de tinción para la detección histoquímica de la actividad de la citocromo oxidasa. Este protocolo utiliza sulfato de níquel-amonio (NiAS), lo que da como resultado un mayor contraste y módulos mejor definidos en las áreas corticales teñidas.

1. Prepare la solución de tinción de citocromo oxidasa. Para 10 mL de solución, agregue 10 mL de tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES) (0,1 M, pH 7,4), 400 mg de sacarosa, 12,5 mg de NiAS, 2 mg de citocromo C y 6 mg de diaminobenzidina (DAB).
   PRECAUCIÓN: El DAB y el NiAS son cancerígenos.
   NOTA: Agregue DAB justo antes de la incubación de las secciones.
2. Lave las secciones en tampón HEPES (0,1 M, pH 7,4) en un agitador durante 15 min.
3. Incubar las secciones en la solución de tinción a temperatura ambiente en un agitador.
   NOTA: Observe la velocidad de la tinción. Si no hay ninguna reacción visible, cambie a la incubación a 37 °C. Dependiendo de la cantidad de fijación, se puede observar tinción después de 10 minutos o en varias horas.
4. Detenga la reacción agregando un 4% de paraformaldehído (PFA); Esto evita que se vuelva a morir no deseado y que aumente la señal de fondo.
5. Lave las secciones tres veces con el tampón HEPES durante 10 min.
6. Monta y seca las secciones en portaobjetos de vidrio.
7. Deshidratar las secciones con una fila de alcohol creciente:
   1. Lave los portaobjetos en etanol al 60% durante 1 min. Lave los portaobjetos en etanol al 80% durante 1 min. Lave los portaobjetos en etanol al 96% durante 2 min. Lave los portaobjetos en etanol 100% durante 3 min. Lave los portaobjetos en isopropanol durante 5 min. Lave los portaobjetos en xileno durante 5 min.
8. Agregue inmediatamente un medio de montaje de endurecimiento rápido y agregue un cubreobjetos. Crítico: No utilice medios de montaje a base de agua, ya que el NiAS se lavará y degradará la mancha.
9. Mantenga las secciones a 4 °C para un almacenamiento a largo plazo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tinción de citocromo oxidasa
Citocromo c de corazón equino	Sigma-Aldrich	C2506
3,3'Diaminobenzidina tetraclorhidrato de hidrato	Sigma-Aldrich	D5637
HEPES	Carl Roth	9105.4
Medios
Eukitt (histoquímica)	Sigma-Aldrich	3989
Deshidratación por
Etanol 100%	Carl Roth	9065.3
Etanol 96%	Carl Roth	P075.3
2-Propanol	Carl Roth	6752.4
Sustituto de xileno	Fluka	78475
Dispositivos/herramientas
Pinzas Dumont 55 - Inox	Fine Science Tools	11255-20
Pinzas Dumont 5 - Punta de Biología de Acero Inoxidable	Herramientas de Ciencia Fina	11252-30
Pinzas Dumont 5SF - Punta Super Fina de Acero inoxidable	Herramientas de ciencia fina	11252-00

de montaje o congelaciónalcohol