Este video demuestra el uso de la citometría de flujo para analizar las células inmunitarias en los nervios ciáticos de ratón y los ganglios de la raíz dorsal (DRG). El proceso consiste en marcar las células inmunitarias con anticuerpos marcados con fluoróforos y biotina, estabilizar y permeabilizar las células, y utilizar marcadores fluorescentes para detectar las características nucleares y de la superficie celular. La técnica permite evaluar cuantitativamente la heterogeneidad de las células inmunitarias en los tejidos nerviosos.
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Artículo de método
Análisis de células inmunitarias en tejidos nerviosos de ratón mediante citometría de flujo
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29 de mayo de 2025
En este artículo
Resumen
Protocolo
Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Digestión del nervio ciático y DRG
- Prepare el medio de digestión (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], 10 mM 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico ácido [HEPES], 5 mg/mL de albúmina sérica bovina [BSA], 1,6 mg/mL de colagenasa tipo 4) suplementado con 100 μg/mL de desoxirribonucleasa, y almacenar en hielo.
NOTA: La cantidad de medio de digestión requerido por ratón (nervios ciáticos + DRG) es de 1 mL. Una vez preparadas, las alícuotas de los medios de digestión pueden almacenarse a -20 °C. - Transfiera los nervios ciáticos y los DRG de un ratón a tubos separados de 1,5 ml que contienen 500 μL de medios de digestión. Para los nervios ciáticos, picar el material en 15-20 pedazos con unas tijeras de resorte y luego incubar las suspensiones de tejido en una incubadora agitadora a 37 °C durante 20 min con agitación suave (≤ 450 rpm).
- Triturar repetidamente la suspensión celular a través de la punta de pipeta de 1.000 μL para disociar mecánicamente cualquier tejido digerido de forma incompleta.
NOTA: Si la suspensión es difícil de valorar, corte la punta de la pipeta con unas tijeras para crear un extremo romo. Incubar la suspensión tisular a 37 °C durante 20 min con agitación suave (≤ 450 rpm). - Repita la trituración a través de una punta de pipeta de 1.000 μL e incube durante 10 minutos más a 37 °C con agitación suave (≤ 450 rpm).
- Prepare el tampón FACS (solución salina tamponada con fosfato [PBS] suplementada con suero fetal de ternero [FCS] al 10% y ácido etilendiaminotetraacético [EDTA] al 1 mM) y guárdelo en hielo. Enjuague y remoje una pantalla de acero inoxidable con un tamaño de malla de 140 μm con tampón de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) en una placa de Petri de 60 x 15 mm sobre hielo.
NOTA: Los filtros de malla de nailon deben evitarse, ya que conducen a una pérdida significativa en el rendimiento de las células nucleadas. - Pase repetidamente las suspensiones de tejido a través del filtro de pantalla de 140 μm, mientras se sostiene sobre la placa de Petri, con pinzas romas, sobre hielo. Recoja la suspensión celular de la placa de Petri y transfiérala a un nuevo tubo de 1,5 ml almacenado en hielo.
- Empuje cualquier tejido digerido incompletamente que permanezca en el filtro mediante trituración repetida con una punta de pipeta de 1.000 μL. Enjuague el filtro de malla dos veces con 500 μL de tampón FACS y recoja la suspensión celular resultante en la placa de Petri para combinarla con la suspensión celular del paso 1.6.
NOTA: Si el citómetro de flujo utilizado es sensible a los residuos, la suspensión celular del paso 1.7 se puede pasar a través de un filtro de pantalla de 70 μm; Sin embargo, esto puede conducir a una pérdida en el rendimiento de las células nucleadas. - Centrifugar las suspensiones celulares a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 mL de tampón FACS. Repita este paso de lavado una vez.
- Vuelva a suspender el pellet celular en 150-350 μL de tampón FACS, dependiendo del número de tinciones que se requieran (150 μL de tampón FACS por panel de tinción).
2. Tinción del nervio ciático y DRG con anticuerpos marcados con fluorescencia para citometría de flujo
- Transfiera 100 μL del nervio ciático o suspensión de células DRG a un pocillo en forma de V en una placa de 96 pocillos en hielo.
NOTA: Las células monoteñidas son necesarias para todos los anticuerpos utilizados, ya que proporcionarán los controles necesarios para establecer la citometría de flujo con respecto a las ganancias y compensaciones de voltaje del tubo fotomultiplicador (PMT), así como para ayudar a distinguir la unión específica de la inespecífica. - Agrupe las suspensiones de células restantes (aproximadamente 50 μL por muestra) de los nervios ciáticos o de las muestras de DRG, para que sirvan como control sin teñir.
- Centrifugar la placa a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante invirtiendo la placa sobre un recipiente y aplicando un movimiento brusco de la muñeca, y seque suavemente las toallas de papel.
- Para la tinción de superficies, vuelva a suspender cada uno de los gránulos celulares en 20 μL de tampón FACS que contenga los anticuerpos de interés (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 y biotina del complejo mayor de histocompatibilidad [MHC] Clase II) e incube, protegido de la luz, en hielo durante 30 min.
NOTA: (1) La dilución óptima del anticuerpo debe determinarse antes de su uso mediante la realización de una dilución serie de acuerdo con la información del producto del fabricante; (2) La tinción inespecífica se puede reducir mediante la incubación con bloque Fc en este paso, de acuerdo con las instrucciones del fabricante; y (3) la tinción de control de isotipo generalmente no es necesaria cuando se utilizan anticuerpos primarios conjugados directamente con un fluoróforo y/o cuando los antígenos de interés producen poblaciones distintas. - Añadir 130 μL de tampón FACS a cada pocillo y centrifugar la placa a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante como se ha descrito anteriormente (paso 2.3) y lavar los pellets de la celda dos veces con 150 μL de tampón FACS.
NOTA: Si se utiliza un anticuerpo primario no conjugado o un anticuerpo primario conjugado con biotina, entonces se puede agregar un reactivo secundario apropiado, conjugado con un fluoróforo, en este punto y se repiten los pasos 2.4-2.5. En el caso de este protocolo, se utilizó estreptavidina-PE/Cy7 o estreptavidina-PerCP para detectar MHC Clase II en combinación con CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5, o en combinación con CD68-APC y F4/80-PE/Cy7, respectivamente. - Para la fijación, después del último paso de lavado, vuelva a suspender los gránulos celulares en 100 μL de paraformaldehído al 4% en PBS (pH 7,4). Incubar la placa en hielo durante 10 min y luego centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante como se describió anteriormente (paso 2.3) y lavar los pellets de celda una vez con 150 μL de tampón FACS.
Precaución: El paraformaldehído es tóxico; Use protección adecuada, como guantes y anteojos, etc.
NOTA: Vuelva a suspender los gránulos de celda en 150 μL de tampón FACS y guárdelos protegidos de la luz, a 4 ° C durante un máximo de dos días. Si no se requiere tinción intracelular, continúe con el paso 2.11 después de centrifugar la placa a 400 x g durante 5 min a 4 °C. - Para la tinción intracelular, vuelva a suspender los gránulos celulares en 150 μL de tampón FACS + detergente al 0,5% e incube a temperatura ambiente, protegido de la luz durante 15 min. Centrifugar la placa a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante como se ha descrito anteriormente (paso 2.3) y lavar el pellet de celda una vez con 150 μL de tampón FACS + 0,5 % de detergente. Vuelva a suspender el pellet celular en 20 μL de tampón FACS + detergente al 0,5% que contenga los anticuerpos de interés (CD68-APC, CD206-PE) e incube, protegido de la luz, a temperatura ambiente durante 30 min.
- Añada 130 μL de tampón FACS + detergente al 0,5% a cada pocillo y centrifugar la placa a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante como antes descrito (paso 2.3) y lavar los pellets de celda dos veces con 150 μL de tampón FACS + 0,5 % de detergente.
NOTA: Si se utiliza un anticuerpo primario no conjugado o un anticuerpo primario conjugado con biotina, entonces se puede agregar un reactivo secundario apropiado, conjugado con un fluoróforo, en este punto y repetir los pasos 2.9-2.10. - Vuelva a suspender los gránulos celulares en 150 μL de tampón FACS + detergente al 0,5 % y almacene, protegidos de la luz, a 4 °C durante un máximo de dos días.
- Vuelva a suspender los pellets celulares con 150 μL de tampón FACS + 0,5 % de detergente suplementado con 5 μg/mL4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e incube durante 5 min a temperatura ambiente, protegido de la luz. Centrifugar la placa a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante como se ha descrito anteriormente (paso 2.3).
- Vuelva a suspender los gránulos celulares en 150 μL de PBS y transfiéralos a un tubo FAC debidamente marcado. Almacene a temperatura ambiente, protegido de la luz, hasta que esté listo para el análisis.
NOTA: Después de la resuspensión en PBS, las células deben analizarse en cuestión de horas, ya que el DAPI se disociará lentamente del ADN, lo que provocará una pérdida de señal.
3. Configuración de la citometría de flujo y toma de muestras
- Asegúrese de que el citómetro de flujo esté equipado con los láseres y/o conjuntos de filtros adecuados para medir los fluoróforos utilizados para teñir las células. Esto se puede determinar en la configuración predeterminada del citómetro en el sistema. En el caso de este protocolo, las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo equipado con tres láseres (405 nm, 488 nm y 633 nm) que permitieron la detección de ≤ 5 fluoróforos.
- Seleccione los canales apropiados para la detección de fluoróforos de interés. Todas las señales fluorescentes se detectan mejor con amplificación logarítmica.
- Seleccione un caudal adecuado para las muestras. Este parámetro puede variar dependiendo del sistema utilizado y debe determinarse empíricamente. En el caso de este protocolo, se utilizó un caudal de MED-a-HI (35-60 μL/min) para evitar la obstrucción de la aguja.
- Seleccione el número total de eventos/celdas que se van a recopilar por muestra. El número mínimo de eventos debe ser 1.000.000.
- Cree diagramas de dispersión bajo una hoja de cálculo global del área de dispersión lateral (SSC-A) frente al área de dispersión directa (FSC-A), así como para cada fluoróforo de interés frente a FCS-A. Cree una vista estadística que muestre el número de eventos y la intensidad fluorescente media (MFI) para los fluoróforos seleccionados.
- Establezca el voltaje de los canales FSC-A y SSC-A, de modo que las celdas más pequeñas quepan en el 10% inferior izquierdo del diagrama de dispersión. Determine la fluorescencia de fondo y la fluorescencia mínima de la muestra a partir de los controles no teñidos de los nervios ciáticos o de los DRG. Determine la puerta principal (P1) en función del diagrama de dispersión de los controles de tinción solo DAPI.
NOTA: Esta no es una puerta de recolección, debido en parte a la naturaleza heterogénea de la población DAPI+ en el sistema nervioso periférico (SNP). - Usando los diagramas de dispersión FSC para cada uno de los fluoróforos de interés, ajuste los voltajes de modo que las celdas del control no teñido caigan dentro del cuarto inferior de sus respectivos diagramas de dispersión. A continuación, se crean puertas por encima de esta región para definir las células que son positivas para cada uno de los respectivos marcadores/fluoróforos. La colocación de una puerta se confirma mediante el funcionamiento del control de una sola mancha (paso 2.1).
NOTA: La compensación de espectros de emisión superpuestos puede realizarse en este punto o aplicarse retrospectivamente con el software de análisis adecuado. - Una vez que se ha configurado el citómetro de flujo, como se describe, se pueden ejecutar las muestras.
- Después de la ejecución, el material de muestra restante se puede descartar y los archivos FCS se pueden exportar para su posterior análisis.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 Mouse | |||
| DMEM (+1g/L glucosa, Glutamina, Piruvato) | |||
| HEPES | |||
| Albúmina sérica bovina (BSA) | |||
| Collagenase Type 4 | |||
| Desoxirribonucleasa (DNasa) I del páncreas bovino I | |||
| Ethylenediaminetetraactic acid (EDTA) | |||
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | |||
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | |||
| Antibody against MHC class II, biotinylated | |||
| Antibody against CD45-A647 | |||
| Streptavidin-PE/Cy7 | Utilizado para detectar MHCII-biotina con CD45-A647 y CDllb-PerCP/Cy5.5 | ||
| Streptavidin-PerCP | |||
| Triton-X 100 | |||
| DAPI | |||
| Cell dissociation sieve - tissue grinder kit | |||
| V-shaped 96-well plates | |||
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | |||
| 60x15mm Petri dish | |||
| BD LSR II Flow Cytometer |
