Obtención de imágenes in vivo de la retina del ratón mediante tomografía de coherencia óptica

Resumen

Source: Jagodzinska, J., et. al., Tomografía de Coherencia Óptica: Imágenes de las Células Gangliales de la Retina del Ratón In Vivo. J. Vis. Exp. (2017)

En este video, demostramos el uso de la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) para obtener imágenes de las capas de la retina y evaluar los cambios estructurales en un modelo de ratón modificado genéticamente con neuropatía óptica.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación del ratón

1. Dilatación e inmovilización ocular
   1. Al menos 15 minutos antes de la adquisición de datos, instilar gotas oftálmicas de fenilefrina al 10% en los ojos del ratón, eliminar el exceso, e instilar gotas oftálmicas de tropicamida al 0,5%.
      NOTA: La primera dilatación se puede hacer de una sola vez para todos los ratones que se van a probar en la sesión. Asegúrese de que los líquidos estén a temperatura ambiente.
   2. Inmediatamente después de inducir la anestesia general (paso 1.2), administrar gotas oftálmicas de clorhidrato de oxibuprocaína al 0,4%, manteniéndolas en su lugar durante 3 s para anestesiar e inmovilizar los ojos. A continuación, limpie las gotas y repita la instilación de fenilefrina al 10% y tropicamida al 0,5% para asegurarse de que los ojos están bien dilatados.
      NOTA: Asegúrese de que los líquidos estén a temperatura ambiente y que el ratón no trague la oxibuprocaína.
2. Anestesia general
   1. Prepare una solución anestésica de ketamina (20 mg/mL) y xilacina (1,17 mg/mL) en solución salina. Conservar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
   2. Aproximadamente 5 minutos antes de la prueba, inyecte por vía intraperitoneal de 5 a 10 μL de solución anestésica por 1 g de masa corporal, dependiendo de la edad y el tamaño del ratón.
      NOTA: Los ratones jóvenes y/o delgados necesitan menos anestesia, tardan menos en anestesiarse, pero también se despiertan más rápido. En este caso, 8 μL/g (160 mg/kg de ketamina, 9,33 mg/kg de xilacina).
   3. Opcionalmente, lubrique los ojos con colirios viscosos o un gel oftálmico para evitar la sequedad corneal.

2. Posicionamiento del ratón

1. Lubrique los ojos con gotas oftálmicas viscosas a base de glicol para proporcionar hidratación corneal.
   NOTA: Si los ojos parecen secos durante el examen, vuelva a aplicar las gotas para los ojos.
2. Envuelva el ratón en una hoja de gasa quirúrgica para mantenerlo caliente.
3. Con una esponja o una mecha de algodón, aplique una capa fina de un gel oftálmico con 0,3% de hipromelosa en cada ojo, para minimizar la refracción de la luz, evitar opacidades y asegurar la hidratación de la córnea. Mientras lo haces, mueve las pestañas y los bigotes a un lado.
4. Coloque el ratón en el casete, con la cabeza recta y apuntando hacia adelante.
5. Abra suavemente la abrazadera de la barra de mordida y colóquela en la boca; Utilice la banda de la nariz para asegurar la posición.
   NOTA: Asegúrese de que la barra de mordida esté en el centro del casete.
6. Coloque un rollo de algodón debajo del lado derecho (izquierdo) si se está examinando el ojo derecho (izquierdo).
7. Mientras mantiene la punta de mira con clip en la lente específica del mouse, llévela hacia el ojo girando el tornillo traductor Z en sentido contrario a las agujas del reloj.
8. Girando y girando el casete y girando la barra de mordida y los tornillos X-translator, preajuste la posición del ratón; El objetivo es que el ojo derecho mire directamente a la lente y, por lo tanto, alinear los ejes ópticos de los ojos y la lente.
   NOTA: Si el ratón está demasiado alto o demasiado bajo, se debe usar primero el tornillo traductor en Y.
9. Elija el primer escaneo en el "Examen", haga clic en "Comenzar a apuntar" y realice cualquier ajuste manual adicional para las imágenes de la retina.
   1. Usando el tornillo traductor Z, mueva la retina verticalmente en el panel izquierdo (Figura 1, Alineación horizontal de B-scan) y horizontalmente en el panel derecho (Figura 1, Alineación vertical de B-scan).
   2. Gire el casete para colocar el ONH en el centro del panel derecho moviendo el ONH hacia arriba o hacia abajo. Use el tornillo de la barra de mordida para enderezar la retina en el panel derecho. Gire el casete para colocar el ONH en el centro del panel izquierdo.
   3. Utilice el tornillo traductor X para nivelar la retina en el panel izquierdo. Teniendo en cuenta la función principal de cada modulador, ajuste aún más la posición de la retina para centralizar la ONH.
      NOTA: Utilice el tornillo traductor en Y para mover el ONH hacia arriba y hacia abajo en el panel derecho, si es necesario. La posición se puede refinar en cualquier momento entre escaneos.

3. Imágenes SD-OCT de la ONH y la retina

1. Una vez satisfecho con los ajustes, haga clic en "Iniciar instantánea" para comenzar el escaneo SD-OCT.
   1. Si no se requiere una imagen 3D, desmarque la opción OCU.
2. Guarde el análisis y el informe.
3. Continúe con los siguientes escaneos.
4. Para obtener una imagen del segundo ojo, después de retraer la lente, gire el casete en consecuencia y repita los pasos 2.6 a 3.3.

4. Finalización de la adquisición

1. Cuando se complete la adquisición, retire el mouse del casete, aplique gel oftálmico con 0.3% de hipromelosa en cada ojo y coloque el mouse en una placa calefactora para despertar.
2. Después de la última adquisición, cierre el software y apague el ordenador y la máquina OCT (botón de alimentación).
3. Limpie el casete con desinfectante.

5. Análisis

1. Para la medición del grosor de la capa de retina, utilice el software de segmentación automatizado proporcionado por el fabricante.
   1. Haga clic en "Paciente", elija el "Examen" deseado de la lista y haga clic en la opción "Revisar examen".
   2. Cargue los datos OCT deseados en el software OCT haciendo clic con el botón derecho en el icono de la carpeta en el escaneo deseado.
   3. Haga clic con el botón derecho en el B-scan; configurar las pinzas habilitando hasta 10 pinzas de medición; e ingresa sus nombres, ángulos y colores.
   4. Elegir el calibrador deseado haciendo clic con el botón derecho del ratón en el B-scan; Colóquelo en consecuencia en la retina para su medición.
      NOTA: Para los escaneos centrados en el ONH, coloque 5 calibradores a cada lado del mismo, equidistantes entre sí. Para el análisis peripapilar, asegúrese de que el calibrador no esté colocado demasiado lejos de la ONH. Para el escaneo radial, analice 10 imágenes por escaneo que fueron elegidas por el software OCT. Sus números se pueden encontrar en la carpeta "Informes".
   5. Guarde los resultados para el análisis en un programa de software de hoja de cálculo haciendo clic con el botón derecho en el B-scan y haciendo clic en "Guardar resultados".
      NOTA: Los resultados se pueden encontrar en la misma carpeta que los datos de escaneo.
2. Alternativamente, utilice el calibre macro casero, "MRI Retina Tool", desarrollado para un programa de procesamiento de imágenes de código abierto (consulte la Tabla de materiales).
   1. Asegúrese de que las macros "Herramienta de retina de resonancia magnética" y "Herramienta de modificación de sección de polígono" estén activas. Cargue la imagen. Haga clic en el botón m para iniciar la medición.
      NOTA: La macro crea automáticamente un casete de medición de 0,2 mm de largo a ambos lados de la ONH. Cada cassette contiene 5 puntos de medición que funcionan como calibradores. Su posición lateral es inalterable y se personaliza para la peripapila en las exploraciones radiales. La posición horizontal de los casetes está predefinida para medir el espesor de RNFL/GCL, pero es fácilmente modificable para medir la capa compleja de GC en su lugar. Si la calidad del escaneo es deficiente, es necesario ajustar la posición horizontal o excluir la imagen del análisis.
   2. Para el ajuste horizontal, haga clic en el botón e. En la ventana recién abierta "Administrador de ROI", elija el primer casete.
   3. Haga clic en el botón de polígono azul y ajuste la posición del primer casete haciendo clic en los bordes de la capa medida en la imagen.
   4. Repita para el segundo casete eligiéndolo primero en la ventana "Administrador de ROI" y luego haciendo clic en la imagen correspondiente. Haga clic en el botón r para volver a medir. Vea los resultados en la ventana "Mediciones".
      NOTA: Los resultados pueden copiarse a un programa de software de hoja de cálculo en cualquier momento. Contienen los siguientes valores para el casete derecho (r), el casete izquierdo (l) y el total: Intden - densidad integrada dentro del casete; Área: área de la medición, en mm2; Len: longitud de la pinza dentro del casete, en mm; Media: intensidad media de la señal dentro del casete; y Std: error estándar de la intensidad media de la señal.
   5. Continúe con la siguiente imagen.
   6. Analice más a fondo los datos en un programa de software de hoja de cálculo.
      NOTA: Para encontrar el grosor medio de la capa, tome los diez valores de Len.

Resultados

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mice
Opa1delTTAG mouse	Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France	-	Ratones knock-in Opa1 portadores de la mutación OPA1 c.2708_2711delTTAG en el fondo C57Bl6/J
Equipment
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System	Bioptigen, Leica Microsystems, Alemania	-	Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software	Bioptigen, Leica Microsystems, Alemania	-	Software para la adquisición y análisis de OCT
ImageJ 1.48v	Wayne Rasband, Institutos Nacionales de Salud, EE.UU.	-	Software para análisis, requiere descargar e instalar dos macros caseras: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
Placa calefactora autorregulable	Bioseb, France	BIO-062	Protección contra la hipotermia
Supplies
almohadillas de gasa 3"x3"	Curad, USA	CUR20434ERB	Protection against hypothermia
Dual Ended Cotton tip applicator	Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA	-	Gel application
Cotton Twists	CentraVet, Francia	T.7979C.CS	Posicionamiento del ratón
Reagents and Drugs
Néosynéphrine Faure 10%	Laboratoires Europhtha, Monaco	-	Eye dilatation
Mydriaticum 0.5%	Laboratoires Théa, France	3397908	Dilatación de ojos
Cebesine 0.4%	Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, Francia	3192342	Local anesthesia
Imalgene 1000	Merial, France/CentraVet, France	IMA004	General anesthesia
Rompun	Bayer Healthcare, Alemania/CentraVet, Francia	ROM001	Anestesia general, analgesia, relajación muscular
NaCl 0,9%	Laboratoire Osalia, France	103697114	Physiological serum
Systene Ultra	Alcon, Novartis, USA	-	Hidratación de los ojos
GenTeal'	Alcon, Novartis, USA	-	Gel oftálmico para minimizar la refracción de la luz y las opacidades
Aniospray Surf 29	Laboratoires Anios, France	59844	Desinfectante