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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Imágenes de lapso de tiempo
- Configuración del microscopio
- Ajuste una cámara climática colocada en la platina de un microscopio confocal invertido a 37 °C y 5% de dióxido de carbono en atmósfera. Utilice un detector híbrido para reducir la intensidad del láser y mejorar la viabilidad de la célula. Para un análisis detallado, utilice un objetivo seco de distancia de trabajo extra larga de 40X con una apertura numérica de 0,6 o superior.
Nota: Todos los componentes del microscopio deben precalentarse a 37 °C durante 2 a 3 h antes de la obtención de imágenes para proporcionar un enfoque estable durante el proceso de obtención de imágenes.
- Imágenes de cortes
- Seleccione un corte de cerebro para obtener imágenes de la placa de 6 pocillos que contiene los insertos de membrana utilizando un microscopio de fluorescencia invertida.
Precaución: Evite el tiempo de exposición prolongado a la luz ultravioleta, ya que esto puede causar fotodaño celular.
NOTA: Seleccione un corte con neuronas individuales brillantes en la SVZ superior (zona subventricular) migrando radialmente hacia la superficie pial del corte. Los finos procesos fluorescentes de las células gliales radiales que abarcan toda la CP (placa cortical) indican un andamio glial radial intacto, que es utilizado por las neuronas corticales que migran radialmente. - Transfiera el inserto de membrana con la rebanada, que se seleccionó para la obtención de imágenes de lapso de tiempo, a un plato con fondo de vidrio de 50 mm de diámetro que contenga 2 ml de medio de cultivo en rodajas con la ayuda de pinzas. Coloque el plato en la cámara climática del microscopio confocal.
- Establezca la resolución en 512 por 512 píxeles y aumente la velocidad de escaneo de 400 Hz a 700 Hz para aumentar la velocidad de fotogramas de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 2,5 cuadros por segundo, respectivamente. No use más de dos veces el promedio. Defina una pila z a través de la región electroporada (generalmente 400-100 μm) con un tamaño de paso de 1,5 μm. En conjunto, estos ajustes permiten una resolución y un brillo suficientes de la imagen, al tiempo que mantienen bajo el daño fotográfico durante la adquisición. Comience la serie de lapso de tiempo tomando una pila z cada 30 minutos.
NOTA: La exposición prolongada del corte a la luz láser inducirá fotodaño reduciendo la viabilidad de las células. Ajuste el tiempo de exposición a la luz láser en consecuencia. - Analice series de lapso de tiempo utilizando el software ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) o equivalente.