Ablación selectiva con láser de una sola neurona en una larva de pez cebra utilizando un microscopio confocal

Resumen

Source: Morsch, M., et. al., desencadenando el estrés y la muerte celular utilizando microscopía confocal convencional con láser UV. J. Vis. Exp. (2017)

En este video, exploramos la técnica de ablación con láser UV de alta intensidad para apuntar y estudiar con precisión las neuronas individuales en el pez cebra transgénico. Demostramos cómo preparar, inmovilizar y visualizar las respuestas neuronales, destacando la dinámica celular de la lesión y la recuperación.

Protocolo

1. Prepare soluciones para la inclusión de pez cebra en agarosa.
   1. Prepare una solución anestésica añadiendo 4 g/L de MS222 (solución madre de tricaína, pH 7,0) gota a gota a una placa de Petri que contenga agua de huevo. Una dosis de 50 mg/L es el punto de partida recomendado (Figura 1A).
   2. Prepare un caldo de agarosa de bajo punto de fusión (0,8 - 1,5%) en agua de huevo y alícuota en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Coloque una alícuota en un bloque de calor precalentado (38 - 40 °C) y deje que se equilibre a la temperatura establecida (~ 30 min; Figura 1B).
   3. Opcional: Para obtener imágenes a largo plazo (> 4 h), prepare un pequeño círculo de agarosa dentro de la placa de Petri con fondo de vidrio de 35 mm y deje que se asiente.
      NOTA: Este paso adicional fue efectivo para evitar cualquier movimiento de toda la caída de agarosa con el pez cebra durante períodos de tiempo más largos.
      1. Para ello, coloque ~ 300 μL de agarosa a lo largo del círculo interior del plato con fondo de cristal para preparar un círculo en forma de rosquilla con una pequeña abertura en el centro para colocar el pescado (paso 1.5.3).
2. Monta el pez cebra en agarosa para microscopía.
   1. Seleccione 1 - 3 de los peces previamente seleccionados para la ablación y anestesiar las larvas transfiriéndolas (utilizando una pipeta de transferencia) a una placa con la solución anestésica (paso 1.4.1; Figura 1C; aproximadamente 5 min).
      NOTA: Los peces son anestesiados cuando muestran un movimiento opercular superficial y una frecuencia cardíaca disminuida y ya no muestran una respuesta de escape evocada por el tacto (TEER; incapacidad para nadar lejos después de tocar suavemente su cola con un cepillo). Asegurar una anestesia adecuada para el tratamiento ético de los peces y para prevenir los espasmos al pasar a la agarosa o exponerse a la luz fluorescente.
   2. Una vez confirmada la anestesia, aspire una larva con una pipeta ajustable (con una punta cortada de 200 μL ajustada a ~ 30 μL) y deje que se hunda hasta el fondo de la punta. Transfiera la larva a agarosa precalentada (paso 1.4.2) liberando una gota del líquido con la larva en la agarosa (intente minimizar la cantidad de agua de huevo que entra en la agarosa; Figura 1D).
   3. Chupa el pescado rodeado de agarosa. Discúndalo rápidamente en el plato de 35 mm con fondo de vidrio previamente preparado.
   4. Use un microscopio de disección y un pincel estándar (delineador largo, tamaño 1) para colocar al animal dentro de la agarosa en el costado (cabeza a la izquierda) de modo que el cuerpo y la cola queden planos (Figura 1E). Si trabaja con varios peces, alinee todos los peces en el plato para que se puedan localizar fácilmente con el microscopio confocal más adelante.
      NOTA: Realice rápidamente este procedimiento de posicionamiento y alineación (puede requerir algo de práctica, ya que la agarosa comienza a cuajar inmediatamente después de la exposición a temperaturas más frías).
   5. Deje el pescado incrustado en agarosa durante 10 a 15 minutos hasta que la agarosa esté firme. Rellene con cuidado la placa de Petri de 35 mm con ~ 2 ml de agua de huevo que contenga tricaína (Figura 1F).

2. Configure el microscopio confocal y los parámetros de imagen

1. Coloque la placa de Petri con la larva incrustada en la etapa del microscopio confocal y concéntrese en el lado dorsal de la médula espinal del animal (usando campo claro). Examine al animal bajo el aumento apropiado (40X) y la configuración fluorescente y visualice la estructura de interés (e.g., intensidad de fluorescencia de las neuronas marcadas o movimiento microglial) para confirmar que todos los parámetros de imagen son los necesarios para la ablación posterior (Figura 2). Utilizamos habitualmente el objetivo 40X para realizar nuestros estudios de lapso de tiempo.
2. Opcional: Para realizar un estudio de lapso de tiempo durante varias horas, es aconsejable registrar uno o varios puntos de tiempo antes de la ablación para establecer la respuesta fisiológica no perturbada de la célula y su entorno (e.g., movimiento microglial para establecer la velocidad y la motilidad basales).
3. Determinar el grosor de la estructura de interés para la ablación con láser UV.
   1. Usando la unidad z, verifique la parte superior e inferior de la estructura de interés (e.g., el soma de la célula) enfocándose manualmente hacia arriba y hacia abajo. Anote el plano z que se ablacionará (e.g., el centro de la celda).
      NOTA: Según la experiencia, este método fue más efectivo al dirigirse a las neuronas de la médula espinal que estaban brillantemente marcadas (una alta relación señal-ruido que permite una fácil visualización de lapso de tiempo después de la ablación; e.g., Figura 4) y ablacionando el medio del soma celular. La fluorescencia del núcleo celular puede ser ventajosa para asegurar una orientación correcta y una alta eficiencia de ablación.

3. Realizar la ablación láser dirigida de células individuales en la médula espinal del pez cebra

NOTA: Para este enfoque de ablación y visualización, se utilizó un microscopio confocal (Leica SP5). El procedimiento de ablación utilizando un diodo de 405 nm para la destrucción específica de la célula se detalla de acuerdo con el software (Leica Application Suite, v2.7.3.9723). Sin embargo, cualquier microscopio confocal convencional que esté equipado con un láser de 405 nm y un módulo FRAP (recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo) o blanqueador permitirá la realización de las mismas manipulaciones celulares, pero potencialmente con configuraciones, parámetros y nombres ligeramente diferentes.

1. Inicie el asistente de FRAP haciendo clic en el menú desplegable en la parte superior del menú de software (Figura 3A, 1, y 2). Observe una nueva ventana con diferentes pasos que permite la configuración de los parámetros específicos para la ablación láser (Figura 3B, 3).
2. Determine los parámetros de la imagen para el enfoque de ablación seleccionando el formato, la velocidad de escaneo (Figura 3B, 4), y el promedio (Figura 3B, 5). Un formato de imagen de 1.024 x 1.024 a una velocidad de escaneo de 400 Hz y un promedio de línea de 4 fue el más aplicable.
   NOTA: Por lo general, no es necesario cambiar la detección espectral (como los parámetros de excitación o emisión), ya que se han determinado en la adquisición anterior.
   1. Si aún no se ha seleccionado el plano z para la ablación (como se describe en el paso 2.4.), presione el botón "Live" y enfoque a través de la muestra hasta que la estructura fluorescente o el plano z deseado que se va a ablacionar esté enfocado.
3. Una vez establecidos los parámetros generales de la imagen, acceda al paso "Blanqueo" (Figura 3C, 6) para controlar los componentes específicos de la ablación.
   NOTA: Una combinación de la intensidad del láser (Figura 3C, 8), la velocidad de escaneo y el promedio que se ha establecido en el paso 3.2 (Figura 3B, 4 y 5), así como el número de repeticiones que se establecerán en el paso 3.5 (Figura 3E, 12), determinará el tiempo total de permanencia del láser UV en el ROI y, por lo tanto, la eficiencia del blanqueo.
   1. Activa el láser de 405 nm activándolo para el procedimiento de blanqueo (Figura 3C, 8).
      NOTA: El mayor éxito con los ajustes antes mencionados se logró con intensidades de láser de 405 nm entre el 60 y el 80% en nuestra configuración experimental. Tenga en cuenta que esta potencia de salida del láser es específica del instrumento y diferirá para cada configuración confocal.
   2. Utilice la opción "acercar" (Figura 3C, 7) para maximizar la intensidad del blanqueo en el ROI seleccionado al reducir el campo de escaneo y, por lo tanto, maximizar el tiempo de permanencia. Alternativamente, use la opción "Punto de blanqueo" del software de elección para este proceso.
4. Seleccione uno o varios ROI (Figura 3D, 10) para la ablación utilizando cualquiera de las herramientas de dibujo en la ventana de adquisición de imágenes (Figura 3D, 9). Por ejemplo, apunte al montículo de axones con la herramienta de dibujo circular de aproximadamente 4 a 8 μm.
   NOTA: El área de ablación se puede ajustar desde un solo píxel hasta un área mayor, dependiendo de la aplicación.
5. Después de establecer el ROI, seleccione el botón "Curso de tiempo" (Figura 3E, 11) y confirme el número de ciclos en que se escanearán/ablacionarán las ROI (Figura 3E, 12). Elija los marcos "Pre-Bleach" y "Post-Bleach" como desee para permitir una visión general de toda la imagen justo antes e inmediatamente después del proceso de blanqueo.
6. Después de establecer todos los parámetros de ablación necesarios, presione "Ejecutar experimento" (Figura 3E, 13) y controle la eficiencia de la ablación.
   NOTA: En nuestra configuración FRAP, se tomará una sola imagen antes y después del ciclo FRAP con la excitación láser adecuada (e.g., Excitación de 488 nm para células que expresan EGFP). Estas imágenes previas y posteriores a la ablación permiten un juicio rápido de qué tan satisfactorio fue el blanqueo de la inversión y qué tan efectivos fueron los parámetros de ablación elegidos.
7. Repita el proceso ajustando la intensidad del láser (Figura 3C, 8), velocidad de escaneo y promedio (Figura 3B, 4 y 5), y repeticiones (Figura 3E, 12) en caso de que el ROI seleccionado aún muestre una alta intensidad de fluorescencia después de completar el ciclo FRAP.

Resultados

Materiales