Imágenes TSPO-PET/CT para detectar la formación de infarto en un modelo murino de accidente cerebrovascular isquémico

Resumen

Fuente: Chaney, A. M., et.al. Imagen PET de la neuroinflamación usando [¹¹C]DPA-713 en un modelo de ratón de accidente cerebrovascular isquémico. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra una técnica para obtener imágenes in vivo de la neuroinflamación en un modelo de ratón de accidente cerebrovascular isquémico utilizando un radiotrazador específico de TSPO. Después de la inyección, el radiotrazador se une a TSPO, una proteína ubicada en la membrana mitocondrial externa y sobreexpresada en las células inmunitarias activadas. Un escáner PET/CT detecta la distribución del radiotrazador y genera una imagen registrada conjuntamente con los datos de la TC, lo que permite una localización precisa de las regiones neuroinflamatorias en el cerebro.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Calibraciones de PET/CT y configuración del flujo de trabajo (6 días después de la cirugía dMCAO)

1. Cree un flujo de trabajo de imágenes en el software de operación del escáner para incluir una adquisición de atenuación de TC, adquisición dinámica de PET C-11 de 60 minutos (discriminación de nivel de 350 - 650 keV, ventana de coincidencia de 3.438 ns), histograma (20 fotogramas: 5 x 15 seg, 4 x 1 min, 11 x 5 min; con corrección de tiempo muerto) y una reconstrucción 3DOSEM-OP (2 iteraciones, 18 subconjuntos) para crear imágenes de 128 x 128 x 159 con un tamaño de vóxel de 0,776 x 0,776 x 0,96 mm.
2. Realice el acondicionamiento de la fuente de rayos X a través del panel de calibración de TC ubicado en la esquina superior izquierda de la interfaz. Esta calibración debe llevarse a cabo semanalmente o antes del escaneo si el sistema no se ha utilizado en las últimas 48 h.
3. Realice calibraciones de oscuridad/luz (D/L) y desplazamiento central (C/O).
   1. Presione el botón de calibración CT (X) en la parte superior izquierda de la interfaz.
   2. Seleccione D/L y C/O para el archivo CT que va a ejecutar, retire la cama del pórtico y ejecute la calibración D/L.
   3. Inserte el lecho de herramientas de calibración en el escáner y ejecute la calibración C/O, asegurándose de cambiar la selección en la interfaz a "herramienta de calibración" en lugar de "paleta de 70 mm".
4. Retire la herramienta de calibración y devuelva la cama de PET estándar, asegurándose de cambiar la selección en la interfaz a "paleta de 70 mm".
5. Asegure una cama de imágenes para 4 ratones en la plataforma del escáner con cinta adhesiva y conecte el tubo de anestesia (Figura 1A). Asegúrese de que el isoflurano fluya a través de los tubos y que no haya torceduras.
6. Empuje la cama hacia adelante para que quede en el centro del campo de visión (FOV), cierre la puerta de la TC y obtenga una vista de exploración de la TC para asegurarse de que la cama esté en la posición correcta.
7. Realizar una calibración "estándar" del escáner PET/CT utilizando un maniquí de fabricación propia que contiene una dosis conocida de solución de C-11 como fuente de radiación.
   1. Prepare una jeringa de 20 mL llena con la dosis de trazador equivalente a la administrada a un ratón (~250 - 350 μCi/9 - 13 MBq de trazador C-11 diluido en solución salina).
   2. Registre la actividad en el patrón utilizando un calibrador de dosis y anote la hora de la medición.
   3. Realice una tomografía por emisión de positrones/tomografía computarizada del estándar utilizando exactamente los mismos parámetros que se utilizarán para obtener imágenes de ratones (como se describió anteriormente). Haga esto semanalmente para crear un factor de corrección para que el escáner PET lo aplique a los datos de imágenes.

2. Configuración del espacio de trabajo para imágenes PET/CT

1. Cree un ambiente estéril utilizando un desinfectante con virucida (ver Tabla de materiales) y colocando un acolchado absorbente protector en todas las superficies.
2. Asegúrese de que los tanques de isoflurano y oxígeno estén adecuadamente llenos.
3. Prepare los catéteres de venas de cola llenando una jeringa de 1 mL (provista de una punta de aguja de 27,5 G) con cloruro de sodio al 0,9% (solución salina estéril) y enjuagándolos a través de un catéter de mariposa de 27,5 G y 24 cm. Corte las alas del catéter antes de canularlo para asegurarse de que no bloqueen la vista de la vena de la cola y para facilitar el movimiento de los ratones en el escáner sin desplazar el catéter.
4. Asegúrese de que todo el equipo esencial esté dispuesto en la estación de trabajo, incluidas las jeringas de repuesto (llenas de solución salina estéril), lubricante para los ojos, hisopos de etanol, lámparas de calor, catéteres preparados (precargados con solución salina), cinta quirúrgica, pegamento para tejidos, jeringas con dosis de 0,5 mL, tijeras y un encendedor para sellar el catéter después de la colocación exitosa en la vena de la cola (Figura 1B).

3. Preparación y canulación de animales

1. Pesar ratones para determinar el volumen máximo permitido inyectar en cada ratón (es decir, el volumen de trazador y cualquier solución salina administrada no debe exceder el 10% del peso corporal).
2. Anestesiar ratones en una cámara de inducción con isoflurano al 3% y mantenerlo al 1-2% (2 L/min 100% O₂).
3. Aplique lubricante ocular a cada ratón y confirme la anestesia a través del reflejo del pedal (pellizco del dedo del pie). Ajuste los niveles de anestesia si es necesario.
4. Coloque el ratón sobre una cama caliente provista de un cono de nariz para suministrar isoflurano al 1-2% (2 L/min 100% O₂).
5. Mientras el ratón está anestesiado, realice la canulación de las venas de la cola utilizando el siguiente protocolo:
   1. Coloque al ratón de lado para exponer una de las venas laterales, mientras la cabeza permanece en el cono de la nariz.
   2. Caliente la cola con una lámpara de calor, teniendo cuidado de no sobrecalentarla o quemarla, y frote con una toallita con alcohol para dilatar la vena y esterilizar el sitio de inyección.
   3. Sostenga la aguja con el bisel hacia arriba y alinéela con la vena en un ángulo agudo.
   4. Aplique una ligera presión para perforar la piel y nivele la aguja para que quede en línea con la vena.
   5. Empuje suavemente hacia adelante unos milímetros más allá del bisel para que la aguja entre en la vena.
   6. Confirme que el catéter está colocado administrando una pequeña capa (10-20 μL) de solución salina. La solución salina debe salir de la jeringa sin problemas y la vena debe aclararse. Si se observa alguna resistencia o contrapresión, es probable que el catéter no esté en la vena y es aconsejable volver a intentar la canulación. Si se observa coagulación, use heparina (1,000 unidades de heparina por ml de solución salina) para la configuración de la canulación y el lavado.
      NOTA: Hemos evaluado la canulación con y sin heparina en la cepa de ratón de interés, y dado que no se observó coagulación, se utilizó solución salina sola para las canulaciones.
   7. Asegure el catéter a la cola con una pequeña gota de pegamento tisular, seguido de cinta quirúrgica, para asegurarse de que el catéter permanezca inmóvil al transferir los ratones al escáner.
   8. Retire la jeringa de descarga del extremo del catéter y selle el extremo con un encendedor, asegurándose de que el investigador no esté cerca de isoflurano o etanol.
   9. Repita el procedimiento para 3 ratones adicionales de modo que los 4 ratones que se van a escanear estén canulados y preparados.
6. Encienda el flujo de anestesia (2,5% de isoflurano, 2 L/minuto 100% O₂) conectado a la PET/CT y coloque cuidadosamente a los ratones boca abajo en la cama del escáner, asegurándose de que los catéteres permanezcan en su lugar y que la cabeza de cada ratón esté recta y segura dentro del cono de la nariz. Sujete la cabeza y el cuerpo de cada ratón a la cama con cinta quirúrgica suave, asegurándose de que la respiración no se vea restringida por la colocación de la cinta. Registre la posición de cada ratón para permitir la ubicación correcta y la asignación de grupos para el análisis de imágenes.
7. Mantenga a los ratones calientes durante todo el procedimiento (e.g., usando una lámpara de calor o un sistema de bomba de aire caliente para asegurar que los ratones se mantengan calientes sin sobrecalentarse). Monitoree la frecuencia respiratoria de todos los ratones, ya sea visualmente si se usa un pórtico abierto o a través de un sistema de monitoreo remoto con almohadillas respiratorias, y modifique los niveles de anestesia según sea necesario.

4. Adquisición de CT

1. Una vez que los animales estén seguros en la cama y la respiración sea estable, encienda el punto de mira láser y mueva la cama de escaneo para que se alineen con el cerebro de los cuatro ratones. Mueva la cama del escáner a la posición de adquisición (posición 3) con el cerebro de los ratones lo más cerca posible del centro del campo de visión.
2. Adquiera una imagen de vista de exploración de los ratones para verificar su posición (use un campo de visión de 200 mm) y ajuste la posición arrastrando el cuadro FOV en la interfaz si es necesario. Haga clic en "Iniciar flujo de trabajo" en el software del escáner para comenzar la tomografía computarizada, asegurándose de seleccionar "mostrar indicaciones interactivas al usuario" para que la exploración PET pueda iniciarse manualmente antes de la inyección del trazador.

5. [¹¹C]Preparación de dosis DPA-713

1. Sintetizar [¹¹C]DPA-713, asegurarse de usar el EPP (equipo de protección personal) adecuado para manipular la radiactividad, incluida una bata de laboratorio, guantes y dosímetros personales para los dedos y el cuerpo. Asegúrese de cambiar los guantes con regularidad para evitar la contaminación radiactiva y aumente la distancia de la fuente radiactiva cuando sea posible.
2. Use fórceps para transferir cuidadosamente el frasco de radiosonda detrás de un protector de plomo.
3. Prepare jeringas con una dosis de 0,5 mL para cada ratón que contengan aproximadamente 250-350 μCi/9-13 MBq en un volumen de 100-200 μL para garantizar una dosis adecuada para una PET dinámica de 60 minutos (la dosis administrada debe determinarse teniendo en cuenta la vida media del isótopo y la línea de tiempo del diseño del estudio, con el volumen dependiendo del peso del ratón).
4. Mida la actividad utilizando un calibrador de dosis ajustado a C-11, ubicado muy cerca del sitio de canulación, y registre los tiempos de medición e inyección para permitir la corrección de la descomposición. Elabore las dosis justo antes de que finalice la TC para limitar la desintegración y asegurarse de que se inyectará el nivel deseado de radiactividad en cada ratón.
5. Verifique que no haya burbujas de aire en la jeringa de dosis antes de medir la actividad e inyectar en cada ratón.

6. Adquisición de PET

1. Una vez que los ratones avanzan automáticamente de CT a PET, configure la parte posterior del escáner para [¹¹C]DPA-713 inyección (Figura 1C). Coloque un acolchado absorbente protector en una repisa y asegúrese de tener a mano las tijeras y el encendedor.
2. Corte el tubo sellado del catéter con unas tijeras, verifique que las líneas del catéter estén libres de burbujas y confirme que la cánula aún esté dentro de la vena realizando un lavado con solución salina de 10 a 20 μL. Cargue las jeringas de dosis medidas del paso 5.4 en cada uno de los 4 catéteres, llevando un registro de la dosis que se administró a cada ratón.
3. Haga clic en "Aceptar" cuando la exploración PET esté lista para comenzar mientras se inicia simultáneamente un temporizador de 10 segundos. Coloque a dos investigadores en la parte posterior del escáner con las jeringas de dosis en la mano, para inyectar a los 4 ratones simultáneamente cuando el temporizador llegue a cero. Enjuague cada catéter con 50-100 μL de solución salina (dependiendo de la longitud del tubo del catéter — es decir, el volumen muerto) para asegurarse de que la dosis completa ingrese a la vena de la cola, y vuelva a sellar el tubo una vez más con un encendedor.
4. Mida las jeringas de dosis con un calibrador de dosis para obtener un valor de radiactividad residual (cualquier marcador que quede en la jeringa). Tome nota de los valores y la hora en que se registran.
5. Una vez que se complete el escaneo, coloque la cama de PET en la posición original usando el botón horizontal de "inicio" dentro del panel de control de movimiento. Retire los ratones del escáner y retire con cuidado el catéter. Aplique presión suavemente en el sitio de la canulación para evitar un sangrado excesivo.
6. Mida la actividad residual en el catéter con un calibrador de dosis.
7. Si se van a recuperar ratones, asegúrese de hacerlo en un ambiente cálido (por ejemplo, en una caja con una almohadilla térmica debajo o que contenga un guante lleno de agua tibia) para facilitar la recuperación. Si planea sacrificar a los ratones, colóquelos en una cámara de inducción que contenga isoflurano para que permanezcan anestesiados antes de la eutanasia por perfusión.
8. Para reconstruir los datos, abra el software de gestión de posprocesamiento (consulte Tabla de materiales), que reconstruirá automáticamente cada escaneo utilizando los datos del histograma que se generaron a partir del archivo lst.

7. Análisis dinámico de imágenes PET

1. Abra el software de análisis de imágenes (consulte Tabla de materiales) y haga clic en el icono "abrir datos" para cargar la imagen CT (como fuente) y en el icono "anexar datos" para cargar el PET dinámico (como referencia).

2. Realice un control de calidad visual de los datos a través del operador de series temporales en el menú desplegable: Seleccione referencia ("ref") y "global" y aplique un mínimo y un máximo adecuados para la escala de colores. Visualice los datos dinámicos de PET fotograma a fotograma, verificando la absorción de radiactividad y comprobando si hay factores de confusión en el movimiento durante el escaneo.

3. Cree una imagen PET promedio usando el "operador aritmético".

1. Elija "promedio seleccionado", anule la selección de "ref" y asegúrese de que la entrada 1 ("Inp1"), la entrada 2 ("Inp2") y la estrella de entrada ("Inp*"-incluye el resto de los fotogramas PET en el escaneo) estén seleccionadas para crear un promedio de todos los fotogramas PET.

2. Vaya a la pestaña "administrador de datos" (DM) y arrastre la imagen promedio hasta la posición "input1" para fines de visualización. Redistribuya la escala de colores haciendo clic en el cálculo automático en la herramienta "min-max".

4. Registre el TC en el archivo PET promedio utilizando la función "3D automático" en el menú desplegable "reorientación/registro".

1. Seleccione "ref" e "Inp1", y elija el registro "rígido", "rápido", "Inp1 a Ref". Compruebe visualmente el registro en las 3 dimensiones y ajústelo manualmente si es necesario en la pestaña "manual 3D" utilizando las funciones de "traducción" y "rotación".

2. Cuando esté satisfecho con el registro, seleccione "Inp2" e "Inp*", y aplíquelo a todos los marcos PET haciendo clic en la marca de verificación. Haga clic derecho en los archivos CT y PET en el DM y guárdelos como sin procesar.

5. Recorte el cerebro de un ratón a la vez para el análisis del cerebro utilizando el TC como guía: Seleccione "recortar" en el menú desplegable y arrastre los límites de la imagen para recortar la cabeza del ratón por debajo del tronco encefálico. Reoriente las imágenes de PET y CT utilizando la función de "reorientación manual en 3D" como se describe anteriormente para que el cráneo quede recto en todas las dimensiones.

6. Cargue la imagen MR para ese mouse (en formato DICOM) usando el botón "agregar datos" en la parte superior izquierda de la interfaz. Mueva la resonancia magnética utilizando la "reorientación manual en 3D" y ajústela al cráneo dentro de la imagen de TC (asegúrese de que todas las modalidades estén en la misma orientación).

7. Dibuje el ROI del trazo en la imagen de resonancia magnética utilizando la "herramienta de ROI 3D".

1. Desactive la visualización de PET anulando su selección dentro de la pestaña del controlador visual (VC) y use solo el MR y el CT para dibujar el ROI.

2. Haga clic en el botón "agregar ROI" para crear un nuevo ROI y asígnele el nombre "infarct". Seleccione la "herramienta spline", haga clic con el botón izquierdo para dibujar el borde del ROI y haga clic con el botón derecho para cerrarlo.

3. Repita a través de todos los cortes que abarcan el trazo, asegurándose de no capturar nada de la calavera en el ROI, siendo la mejor práctica dejar un espacio de vóxel entre el borde del cráneo y el ROI del trazo.

8. Generar un ROI contralateral utilizando el volumen del infarto.

1. Crea un nuevo ROI y etiquétalo como "contralateral". Haga clic derecho en el ROI de Infartt y seleccione "exportar". Arrastre el ROI a la posición 2 ("Inp1").

2. Con solo "Inp1" seleccionado, aplique un giro de izquierda a derecha usando la función "operador" dentro del menú "reorientación/registro". Marque la casilla "ROI", elija "solo lectura" y mueva manualmente el nuevo ROI a la región idéntica en el lado contralateral. Seleccione el operador "aritmético" y aplique una multiplicación escalar de 2 al nuevo ROI, lo que permite la cuantificación independiente de los ROI.

3. Vuelve a la herramienta de ROI 3D. Vaya a la pestaña "experto y experimental" y haga clic en el botón "importar ROI". Seleccione Inp1 en el cuadro de diálogo para cargar el nuevo volumen como ROI contralateral.

9. Haga clic con el botón derecho en la imagen de PET promedio, descárguela y vuelva a encender la PET. Genere los resultados cuantitativos de absorción utilizando el icono "exportar resultados" dentro de la herramienta ROI 3D.

10. Realice análisis adicionales del cerebro dividido si lo desea (es decir, generación automatizada de ROI de las regiones del hemisferio cerebral derecho frente al izquierdo utilizando un módulo de complemento de atlas cerebral de ratón 3D para el software Vivoquant).

1. Vuelva a cargar las imágenes PET/CT registradas.

2. Importe el atlas del cerebro del ratón haciendo clic en el menú "módulos avanzados" y seleccionando la herramienta del atlas del cerebro en 3D. Seleccione "todas las regiones izquierda/derecha" en la "configuración avanzada" y haga clic en "ejecutar" para importar el atlas 3D.

3. Ajuste manualmente el atlas dentro del cerebro usando el cráneo como borde.

4. Vuelva a ejecutar el atlas asegurándose de que se marque la opción "importar ROI 3D" para generar una hoja de cálculo de resultados para los 14 ROI de los hemisferios izquierdo y derecho (médula, cerebelo, mesencéfalo, protuberancia, corteza, hipocampo, tálamo, hipotálamo, cuerpo estriado, pálido, bulbos olfativos, cuerpo calloso y sustancia blanca).

11. Cuantifique la absorción del trazador en el bazo utilizando el software operativo del escáner (véase Tabla de materiales).

1. Cargue los archivos de imagen PET y CT resaltándolos en la base de datos y haciendo clic en "análisis general".

2. Haga clic en la pestaña de registro y co-registre las imágenes de PET y CT haciendo clic en el icono de "registro rígido".

3. Haga clic en la pestaña de cuantificación del ROI, haga clic en el icono "crear ROI" y asígnele el nombre spleen.

4. Elija la herramienta "esfera" para dibujar las ROI del bazo utilizando el archivo CT como referencia, asegurándose de que no haya superposición con la captación renal (utilizando la imagen y la señal PET para evitar el desbordamiento de los riñones).

5. Edite los ROI para mantener volúmenes de ROI consistentes entre los animales.

12. Calcule un valor de corrección estándar para la normalización de la absorción.

1. Cargue los datos de PET/CT del escaneo estándar y cree un ROI del cilindro que abarque la jeringa de 20 mL utilizando la herramienta "ROI 3D manual".

2. Obtener el nivel de radiactividad contenido en el estándar utilizando el icono de la hoja de cálculo.

3. Utilice este resultado de nCi/cc y la radiactividad registrada originalmente para el patrón (es decir, la medición del calibrador de dosis del patrón en nCi/cc) para crear un factor de corrección para los valores de absorción de PET. Es decir, dividir la radiactividad del patrón registrada por el calibrador de dosis por la radiactividad calculada a partir de la imagen PET del patrón.

13. Utilice las actividades de dosis y el tiempo de las mediciones para corregir la decaimiento hasta el momento de la adquisición de la PET para todos los ratones (es decir, calcular la actividad de la dosis al comienzo de la exploración PET).

14. Repita para los valores residuales y reste de la dosis corregida por decaimiento para calcular la actividad exacta que recibió cada animal.

15. Después de aplicar esta corrección de decaimiento, aplique también la corrección estándar para asegurarse de que los datos estén en el nivel de actividad correcto. Asegúrese de que estas correcciones se apliquen a los resultados de ROI dibujados manualmente y a las regiones cerebrales relevantes de los datos de ROI del atlas cerebral para la ubicación de dMCAO (es decir, corteza, hipocampo y cuerpo estriado).

16. Calcule el %ID/g para todos los ROI utilizando la siguiente ecuación: %ID/g = (ROI radiactividad en nCi/cc / dosis corregida por decaimiento recibida en nCi/cc) x100. Trace %ID/g en función del tiempo utilizando software de gráficos para generar curvas de actividad de tiempo para cada ROI.

17. Utilice el software de escáner para la visualización de la imagen final y la generación de figuras. Normalice las imágenes de acuerdo con la dosis corregida de decaimiento recibida por cada ratón en el momento de la exploración, asegurándose de que todas las imágenes estén en la misma escala de %ID/g.

NOTA: Esto es necesario para permitir una comparación precisa de imágenes de diferentes ratones y/o imágenes de estudios realizados en diferentes días.

Resultados

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Inveon PET/CT scanner	Siemens	Version 4.2
VivoQuant software	InVicro	Version 2.5	Software de análisis de imágenes
Inveon Research Workspace software	Siemens	Version 4.2	Scanner operating software. Incluye microQView, el software de gestión de posprocesamiento
Dose calibrator	Capintech		CRC-15 PET
Typhoon phosphor imager 9410	GE Healthcare	8149-30-9410
Butterfly catéters	SAI Infusion Technologies	BFL-24	27.5 G needle
1 mL jeringas	BD
Jeringas de insulina	BD	329461	0.5 mL jeringas de insulina con aguja
20 mL syringe	VWR	BD302831	BD Jeringa Punta Deslizante Graduada
Tissue glue	Santa Cruz Animal Health	sc-361931	3 mL
Lámpara de calor	Fluker	27002	5.5" lámpara de calor reptile con abrazadera e interruptor
0.9% solución salina estéril	Pfizer	00409-4888-10	0.9% cloruro de sodio para inyección, 10 mL
Chux absorbent sheets	ThermoFisher Scientific	1420662	Acolchado absorbente desechable
Tijeras de iris	World Precision Instruments	503708-12	11.5cm, Straight, 12-pack
Cinta quirúrgica	3M Durapore	1538-0	1/2"X10 yard roll, seda, hipoalergénico
Cama de ratón PET	In house		4 ratón PET bed
Lighter	Bic	UDP2WMDC
Isoflurano	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	Isothesia, inhalation anestésico, 250 mL
Oxygen	Praxiar	UN1072	Compressed gas
Lubricante para ojos	Watson Rugby	PV926977	Artificial Tears Lubricante Eye Ointment, 1/8 oz