Seguimiento morfológico y fisiológico de esferoides tumorales mediante tomografía de coherencia óptica

Resumen

Fuente: Huang, Y. et. al., Seguimiento morfológico y fisiológico longitudinal de esferoides tumorales tridimensionales mediante tomografía de coherencia óptica. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra el uso de la coherencia óptica tomografía (OCT) para monitorear los esferoides tumorales en una placa de pocillos múltiples mediante la captura de imágenes transversales de alta resolución. Mediante el análisis de los reflejos de la luz de las estructuras celulares, OCT construye modelos 3D para evaluar las características morfológicas como el tamaño y la forma, al tiempo que distingue las células viables de las no viables en función de los cambios en la dispersión de la luz a lo largo del tiempo.

Protocolo

1. Preparación de células

1. Obtenga líneas celulares de un proveedor calificado.
   NOTA: Verifique que las células de las líneas celulares de interés puedan formar esferoides en el medio de cultivo o con la ayuda de un sustrato (matriz de membrana basal como Matrigel). Busque en la literatura o realice una ronda de un pre-experimento para verificar.
2. Descongele las células congeladas siguiendo el procedimiento específico proporcionado por el proveedor de la línea celular. Un procedimiento general se puede encontrar en otro lugar.
3. Cultive las células durante 1-2 pasos en matraces de cultivo de 25 cm². A continuación, las células están listas para su uso en el cultivo celular en 3D.
4. Controle diariamente el estado de salud de las células y manténgalas en una incubadora en condiciones estándar (37 °C, 5% de CO₂, 95% de humedad). Actualice los medios según sea necesario.
   NOTA: El medio de cultivo consiste en medio Águila Modificada de Dulbecco (DMEM) (4,5 g/L de glucosa), 1% antibiótico-antimicótico y 10% suero fetal bovino (FBS). Células de subcultivo antes de que alcancen la confluencia en el matraz de cultivo. Siga las pautas de cultivo celular proporcionadas por el proveedor. Un procedimiento general se puede encontrar en otro lugar.
5. Realice el cultivo celular 3D en placas de pocillos múltiples según el siguiente protocolo general.
   1. Retire los medios de cultivo del matraz de cultivo y lávelo con solución salina esterilizada tamponada con fosfato (PBS, calentada a 37 °C).
   2. Vuelva a suspender las células añadiendo 1 mL de ácido etilendiaminotetraacético de tripsina (EDTA, 0,5%) en el matraz durante 3 min. A continuación, añada medios de cultivo para diluir la tripsina.
   3. Transfiera la suspensión de la celda a un tubo de centrífuga de 15 mL y centrifuga durante 5 minutos a 500 x g y temperatura ambiente.
   4. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 4 mL de medio de cultivo precalentado. Pipetee una gota de la muestra en un hemocitómetro para el recuento de células y determine la concentración de células. Diluya las células hasta la concentración adecuada para la siembra (e.g., , 3.000 células/mL).
      NOTA: Optimice la concentración celular inicial del esferoide para cada línea celular y cada tipo de placa de pocillos múltiples (96 pocillos, 384 pocillos o 1536 pocillos).
   5. Siembre las células en una placa multipocillo de fondo redondo de fijación ultra baja (ULA). Agregue 200 μL de suspensión celular en cada pocillo a una concentración de 3.000 celdas/mL para que cada pocillo tenga aproximadamente 600 celdas.
   6. A temperatura ambiente (RT), centrifugar toda la placa con un adaptador de placa durante 7 minutos, justo después de la siembra, a una velocidad de 350 x g o la velocidad más baja disponible.
      NOTA: La centrífuga ayuda a reunir las células en el centro del pozo para facilitar la formación de un esferoide único y uniforme. El paso de centrífuga se realiza solo una vez al principio para formar los esferoides tumorales. No se repetirá cuando los esferoides tumorales comiencen a crecer.
   7. Mantenga la placa de pocillos múltiples a 37 °C y 5% de CO₂ en una incubadora de cultivo y refresque los medios de cultivo cada 3 días.
      NOTA: El tiempo de crecimiento puede variar para diferentes condiciones de cultivo 3D. En nuestro estudio, se utilizan 3.000 células/ml para las líneas celulares U-87 MG y HCT 116 en placas de 96 pocillos, de modo que el esferoide puede crecer hasta ~500 μm en 4\u20127 días para las células HCT 116. Según el protocolo general de cultivo 3D, considere la posibilidad de agregar suplementos de medios y factores de crecimiento para diferentes modelos de esferoides.
   8. Realizar imágenes de tomografía de coherencia óptica (OCT) de esferoides tumorales cada 3 a 4 días para un estudio longitudinal de su crecimiento.
      NOTA: Los puntos de tiempo recomendados para las imágenes de OCT son el día 4, el día 7, el día 11, el día 14, el día 18 y el día 21.

2. Plataforma de imágenes OCT de alto rendimiento

NOTA: Véase Figura 1 para obtener detalles del sistema de imágenes OCT personalizado utilizado en este estudio.

1. Elija una fuente de luz de banda ancha adecuada para el sistema OCT para la obtención de imágenes de esferoides tumorales.
   NOTA: Aquí, se utilizó como fuente de luz de banda ancha un diodo superluminiscente (SLD, TAG_223, B) con una longitud de onda central de ~1.320 nm y un ancho de banda de 110 nm.
2. Construya el brazo de referencia y el brazo de muestra del sistema OCT siguiendo los esquemas (véase Figura 1A, B para más detalles). La Table of Materiales enumera los componentes ópticos necesarios para construir el sistema OCT. Asegúrese de que las longitudes de la trayectoria óptica del brazo de referencia y del brazo de muestra coincidan estrechamente.
3. Construya el espectrómetro, incluyendo un colimador, una rejilla, una lente F-theta y una cámara de escaneo lineal (Ver Figura 1C para la configuración) para obtener detalles del diseño del espectrómetro de OCT. Alternativamente, seleccione un espectrómetro comercial que coincida con la longitud de onda central de la fuente de luz. Asegúrese de que el espectrómetro esté alineado correctamente para cubrir todo el ancho de banda del láser, para lograr una alta eficiencia de recolección de fotones y para proporcionar un lavado lento del patrón de interferencia.
4. Caracterice el rendimiento del sistema OCT, incluidas las siguientes métricas, como la potencia del brazo de muestra, la profundidad total de la imagen, la sensibilidad dependiente de la profundidad, la resolución axial, la profundidad de enfoque y la resolución lateral. Coloque un reflector débil (e.g., , un espejo con un filtro de densidad neutra) como muestra para medir la sensibilidad dependiente de la profundidad, la resolución axial y la profundidad de enfoque. Coloque un objetivo de gráfico de prueba de resolución de la Fuerza Aérea de los Estados Unidos (USAF) como muestra para verificar la resolución lateral.
5. Seleccione una etapa de traslación motorizada para proporcionar un movimiento horizontal de la placa de pocillos múltiples para obtener imágenes de esferoides tumorales en diferentes pocillos (ver Figura 1B). Utilice una platina con un rango de recorrido superior a 108 mm x 72 mm para garantizar un escaneo completo de todos los pocillos de la placa de pocillos múltiples. Utilice una etapa de traducción motorizada bidimensional (2D) o tridimensional (3D) con control de software para permitir la ubicación precisa de cada pozo y la automatización del sistema OCT para obtener imágenes de alto rendimiento.
6. Utilice un adaptador de placa o diseñe un soporte de placa (mediante impresión 3D) para sujetar la placa de pocillos múltiples en una posición fija.
7. Antes de realizar cualquier toma de imágenes OCT, corrija la inclinación y rotación de la placa de pocillos múltiples utilizando una etapa de inclinación 2D y una etapa de rotación montada en la etapa de traslación (Ver Figura 1D) para minimizar la variación del plano de enfoque de diferentes pozos. Utilice D2, D11, B6, D6 y G6 como pozos guía cuando monitoree sus posiciones relativas en las imágenes de OCT (Figura 1A).
8. Ajuste la rotación de la placa para asegurarse de que los bordes sean paralelos a la dirección del movimiento de la etapa, de modo que los pozos permanezcan en las mismas posiciones horizontales en las imágenes OCT (Figura 1E). Ajuste la inclinación de la placa para que sea paralela a la mesa óptica, de modo que los pozos permanezcan en las mismas ubicaciones verticales para la obtención de imágenes OCT (Figura 1F).
   NOTA: El ajuste del ángulo de inclinación y enfoque ayuda a optimizar la calidad de la imagen OCT para todos los pozos. Sin embargo, las variaciones de la altura de los medios de cultivo en diferentes pocillos pueden causar cambios en las trayectorias ópticas, lo que puede conducir al desenfoque de la imagen esferoide. El enfoque automático se puede implementar para controlar el plano focal de las imágenes OCT para lograr una calidad de imagen optimizada. El paso de ajuste no resuelve la mala calidad de la imagen OCT del esferoide tumoral debido a los siguientes problemas: el descentramiento del esferoide debido a la ubicación de siembra inicial; elevación de esferoides cuando se incrustan en matrices extracelulares biofabricadas; Mala calidad de la placa con grandes variaciones de la altura de los fondos de los pozos. Se puede implementar un control de software adicional con funciones de enfoque automático o autoalineación para optimizar el rendimiento del sistema de imágenes OCT.
9. Para recopilar datos de cada pozo secuencialmente, un programa informático personalizado controla la adquisición de imágenes OCT y el movimiento de la etapa.

3. Exploración y procesamiento de esferoides tumorales por OCT

1. El día de la toma de imágenes por OCT de esferoides tumorales, retire la placa de pocillos múltiples de la incubadora. Transfiéralo al sistema de imágenes OCT y colóquelo encima del adaptador de placa.
   NOTA: Las imágenes OCT de esferoides tumorales se pueden realizar con la tapa de la placa de poliestireno puesta o desactivada. Sin embargo, las condensaciones de agua en la tapa debido a la evaporación de los pozos pueden afectar la transmisión de luz y distorsionar la trayectoria de la luz, produciendo imágenes OCT menos óptimas de los esferoides.
2. Ajuste la altura de la placa moviéndose a lo largo de la dirección z de la etapa de traslación. Mantenga la posición del plano focal a ~100-200 μm por debajo de la superficie superior de cada esferoide, para minimizar el efecto del perfil focal de profundidad no uniforme.
3. En el software personalizado, establezca un rango de escaneo OCT adecuado (e.g., , 1 mm x 1 mm) para cubrir todo el esferoide tumoral de acuerdo con sus etapas de desarrollo. Haga clic en Guardar parámetros para guardar la configuración.
4. Utilice el software personalizado para adquirir imágenes OCT 3D de esferoides tumorales uno por uno para todos los pocillos de la placa que contienen esferoides. Haga clic en el botón Preview para ver la imagen de vista previa y haga clic en el botón Acquire para adquirir la imagen OCT.
   NOTA: Asegúrese de que los datos del esferoide OCT se recopilen cuando el escenario no esté en movimiento. El esferoide generalmente se encuentra en el centro del pozo de fondo en U. Sin embargo, el esferoide puede desplazarse en el medio de cultivo cuando la etapa se está acelerando o desacelerando debido a la inercia del esferoide en el medio de cultivo.
5. Procese conjuntos de datos de OCT 3D de esferoides tumorales para generar imágenes estructurales de OCT con un código de procesamiento C++ personalizado. Véase Figura 2A para un diagrama de flujo del posprocesamiento de los datos de la OCT.
   NOTA: Véase Figura 3A para las imágenes estructurales OCT 3D generadas.
   1. Calibra el tamaño de píxel en las tres dimensiones. Vuelva a escalar las imágenes estructurales OCT en escalas corregidas.
      NOTA: La distancia en la dirección axial (dirección z) de las imágenes OCT mide la diferencia de trayectoria óptica entre el brazo de referencia y el brazo de muestra. Por lo tanto, el índice de refracción de la muestra (n) debe tenerse en cuenta al calibrar el tamaño de píxel en la dirección axial para el reescalado. En nuestro estudio, utilizamos n = 1,37 como índice de refracción del esferoide tumoral.
6. Genere un collage de imágenes de esferoides utilizando imágenes OCT 2D en tres planos de sección transversal XY, XZ e YZ a través del centroide del esferoide. Véase Figura 4C–E para la salida representativa de collages de imágenes esferoides. Realice el registro de imágenes para todos los esferoides, utilizando la función dftregistration de MATLAB, para asegurarse de que los centroides de todos los esferoides se encuentren aproximadamente en la misma ubicación.
7. Obtenga una representación 3D del esferoide utilizando software comercial o personalizado.
   NOTA: Los siguientes pasos muestran cómo obtener la representación 3D de esferoides tumorales utilizando software comercial.
   1. Cargue los datos OCT 3D en el software.
   2. Haga clic en el panel Surpass. A continuación, haga clic en Añadir nuevo volumen. Elija el modo Blend para usar en el renderizado 3D.
   3. Ajuste el ángulo de visión arrastrando la imagen con el puntero del ratón.

4. Cuantificación morfológica de esferoides tumorales en 3D

NOTA: Un código escrito a medida en MATLAB procesa esta cuantificación. Haga clic en el botón Run para iniciar el proceso. Véase Figura 2B para el diagrama de flujo de las etapas de la cuantificación morfológica de los esferoides.

1. Cuantifique el diámetro del esferoide, la altura y el volumen basado en el diámetro.
   1. Seleccione imágenes OCT 2D en tres planos de sección transversal XY, XZ e YZ que atraviesan el centroide del esferoide.
   2. Mida el diámetro y la altura del esferoide en los planos XY y XZ, respectivamente.
   3. Calcule el volumen del esferoide basado en el diámetro usando:

, con una presunción de la forma esférica del tumor.

2. Cuantifique el volumen de esferoides basado en vóxeles.
   1. Aplique un filtro de promedio 3D en los datos estructurales OCT del esferoide para eliminar las manchas.
   2. Segmente los esferoides tumorales utilizando el filtro de detección de borde Canny, fotograma a fotograma, con un umbral adecuado que separe la región del esferoide tumoral del fondo del pozo.
   3. Vóxeles conectivos de grupo para datos 3D (consulte la función integrada: bwconncomp).
   4. Calcule la distancia media entre cada vóxel conectivo del grupo y el centroide esferoide (elegido manualmente), para cada grupo. Identifique la región esferoide como el grupo con la distancia media mínima.
   5. Cuente el número de vóxeles dentro de la región esferoide y, a continuación, multiplíquelo por el volumen real de un vóxel individual (volumen/vóxel), lo que da como resultado el volumen total del esferoide.

5. Detección de la región de células muertas de esferoides tumorales en 3D

NOTA: En un medio homogéneo, la intensidad retrodispersada de la OCT detectada en función de la profundidad (I({TAG_684}}z)) puede describirse mediante el Ley de Beer-Lambert:

Donde z representa la profundidad, μ es el coeficiente de atenuación óptica, y I0 es la intensidad incidente de la muestra. Por lo tanto, el coeficiente de atenuación óptica derivado se puede expresar como:

Dado que las imágenes de OCT a menudo se trazan en una escala logarítmica, la pendiente del perfil de intensidad de OCT se puede recuperar para derivar el coeficiente de atenuación óptica. Véase Figura 2C para un diagrama de flujo de la generación de los mapas de atenuación óptica.

1. Realice la segmentación para eliminar las regiones no deseadas fuera del esferoide. Realice un filtro de promedio 3D para suprimir el ruido moteado que es inherente a las imágenes OCT.
2. Obtenga coeficientes de atenuación óptica por píxeles ajustando linealmente el perfil de intensidad OCT a escala logarítmica en un cierto rango de profundidad (ventana móvil), extrayendo su pendiente y multiplicando la pendiente por -1/2.
   NOTA: El coeficiente de atenuación en cada vóxel dentro de la región esferoide segmentada se calcula en función de la pendiente del perfil de intensidad de OCT en una ventana de profundidad de 10 vóxeles (~40 μm de profundidad), con el vóxel ubicado en el centro de la ventana.
3. Aplique los métodos anteriores (pasos 5.1 y 5.2) a cada escaneo axial de un fotograma y a cada fotograma de un conjunto de datos 3D que contenga la región esferoide segmentada hasta que se calculen los coeficientes de atenuación óptica para todos los vóxeles de la región esferoide segmentada.
4. Realice el umbral binario para resaltar la región de alta atenuación.
   Resalte el mapa de atenuación óptica binarizada en la imagen original para etiquetar la región de celdas muertas (fusión). Genere la imagen renderizada en 3D del mapa de atenuación combinado para visualizar la distribución en 3D de la región de celdas muertas.

Resultados

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistema de imágenes OCT de dominio espectral personalizado			Desarrollado en nuestro laboratorio
Diodo superluminiscente (SLD)	Thorlabs	SLD1325	Fuente de luz
2×2 acoplador de fibra fusionada monomodo, Año 50:50 50 relación de división	AC Photonics	WP13500202B201
Reference Arm
Tubo de lente	Thorlabs
Thorlabs
Lente colimadora	Thorlabs	AC080-02 0-C
Lente de enfoque	Thorlabs
Thorlabs
Espejo	Thorlabs	{{}} {{}} TAG_107}}
1D Etapa traslacional	Thorlabs
Thorlabs
Publicación pedestal	Thorlabs
Horquilla de apriete	Thorlabs
Brazo de muestra
Tubo de lente	Thorlabs
Adapter	Thorlabs
Lente colimadora	Thorlabs	AC080-020-C
Galvanómetro	Thorlabs{TAG_195{}}Thorlabs{{}}{ }}
Lente de relé	Thorlabs	AC254-100-C	Dos lentes de relé para hacer un telescopio setup
Montaje de espejo triangular	Thorlabs
Espejo	Thorlabs
Objective	Mitutoyo		{{ TAG_239}}
Publicación pedestal	Thorlabs
Horquilla de apriete
Controlador de polarización	Thorlabs		{{ TAG_269}}
Montaje en jaula de 30 mm	Thorlabs
Varilla de jaula	Thorlabs
Escenario			{{ TAG_299}}
Etapa de traducción motorizada 3D	Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., , Ltd.	JTH360XY
2D Escenario basculante
Etapa de rotación	{{TAG_ 325}}
Soporte de placas			Impreso en 3D
Espectrómetro
Tubo de lente	Thorlabs{{TAG_ 355}}
Adapter	Thorlabs
Lente colimadora	Thorlabs	AC080-020-C
Grating	Wasatch	G = 1145 lpmm
F-theta lens	Thorlabs	FTH-1064-100
Cámara de escaneo lineal InGaAs	Sensor ilimitado	SU1024-LDH2
Componente de cultivo celular{{TAG_ 414}}
HCT 116 Línea celular	ATCC	CCL-247
Matraz de cultivo celular	SPL Life Sciences	70025
Pipeta	Fisherbrand	14388100
Puntas de pipeta	Sorenson Bioscience	10340{TAG_459{}10340{{ }}
Gibco GlutaMax DMEM	Thermo Fisher Scientific	10569044
Suero fetal bovino, certificado, origen estadounidense	Thermo Fisher Scientific	16000044
Antibiótico-Antimicótico (100X)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Corning 96-well clear round round ultra-low attachment microplaca	Corning	7007
Gibco PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%)	Thermo Fisher Scientific	15400054
Forma Serie II 3110 Encamisada de Agua CO2 incubadora	3120
Guantes	VWR	89428-750
Parafilm	Sigma-Aldrich{{ TAG_555}}	P7793
Pipetas de transferencia	Globe Scientific	138080
Centrífuga	Eppendorf	5702 R	Para centrifugar el tubo de 15 mL
Centrífuga{{ TAG_583}}	NUAIRE	AWEL CF 48-R	Para centrifugar la placa de 96 pocillos
Microscopio	Olympus
Lista de PTU comerciales
Sistema SD-OCT	Thorlabs	Serie Telesto
SD-SD-Sistema OTT	Wasatch Photonics	WP OCT 1300 nm
Software para análisis de datos{{TAG_ 637}}
Análisis básico de imágenes	NIH	ImageJ	Fiji también funciona.
3D Rendering	Thermo Fisher Scientific	Amira	Software comercial. Opción 1
3D Rendering	Bitplane	Imaris	Software comercial. Opción 2. Utilizado en el protocolo
OCT software de adquisición			desarrollado a medida en C++.
Control de escenario	Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.	MRC_3	Incorporado en el código de adquisición OCT personalizado
Software de procesamiento OCC			Desarrollado a medida en C++. Utilice la GPU. Incorporado en el código de adquisición OCT personalizado.
Análisis morfológico y fisiológico			Desarrollado a medida en MATLAB

{{ TAG_62}}Adaptador{{TAG_ 92}}Montura de espejo cinemático{{ TAG_122}}Filtro de densidad neutra continua{TAG_136{ }} {{ TAG_151}}{TAG_166{ }} {{TAG_ 181}}{{{}}{{}}{TAG_254{ }}Thorlabs{{TAG_340 }}{{}}{{}}{{}}{{TAG_ 386}} {{TAG_400 ^}}{{TAG_ 473}}{TAG_534}}Thermo Fisher Scientific{{ TAG_540^}}{{ TAG_610}}