Obtención de imágenes de polisomas aislados del cerebro de un ratón mediante microscopía de fuerza atómica

Abstract

Fuente: Lunelli, L., et. al. Observando los polisomas cerebrales con microscopía de fuerza atómica. J. Vis. Exp.(2016).

Este video muestra la obtención de imágenes de polisomas utilizando microscopía de fuerza atómica. Una lámina de mica recubierta de iones de níquel ancla el ARN con ribosomas unidos. La muestra se lava, se seca y se monta en la platina del microscopio. La punta en voladizo escanea la superficie de la muestra, registrando las desviaciones del láser para mapear la topología. El software se utiliza para corregir distorsiones y visualizar estructuras de polisomas de alta resolución.

Protocol

Precaución: Para evitar cualquier degradación del ARN de las muestras, prepare todos los tampones utilizando agua tratada con DEPC para minimizar la contaminación por RNasa.

1. Preparación de polisomas a partir de cerebros enteros

1. Recolección de tejidos cerebrales (15 min)
   1. Eutanasia de la cepa de ratón de tipo salvaje C57BL/6 con CO₂ asfixia durante 5 min. Diseccione cuidadosamente el cerebro del cráneo, coloque el tejido en un tubo de 1,5 ml e inmediatamente colóquelo en nitrógeno líquido. Conservar a -80 °C hasta su uso.
2. Preparación del lisado (30 min)
   1. Pulverizar todo el tejido cerebral con un mortero bajo nitrógeno líquido.
   2. Transfiera aproximadamente 25 mg de polvo a un tubo de microcentrífuga fría e inmediatamente (para evitar la descongelación del tejido pulverizado) agregue 0,8 ml de tampón de lisis (vea la Tabla 1) y altere la celda pipeteando hacia arriba y hacia abajo 25 veces rápidamente.
   3. Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 1 min a 4 °C para granular los residuos celulares.
   4. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga y mantenga el tubo en hielo durante 15 min.
   5. Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 5 min a 4 °C para granular los núcleos y las mitocondrias.
   6. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga.
   7. Almacene el sobrenadante a –80 °C durante un máximo de 6 meses o utilícelo inmediatamente.
3. Preparación y centrifugación del gradiente de sacarosa (2 h y 30 min)
   1. Lave los tubos de ultracentrífuga ampliamente con agua libre de RNasa (agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC-agua) o comercial) y 3% de H₂O₂/DEPC H_{2{{TAG_ 126}}}O solución.
   2. Coloque los tubos en hielo y agregue 5,5 ml de solución fría de sacarosa al 50% en el fondo de cada tubo (ver Tabla 1 para soluciones de sacarosa). Agregue con cuidado la solución de sacarosa al 15% gota a gota, permaneciendo cerca de la interfase para preservar una interfase aguda hasta que el tubo esté completamente lleno. Cuando el tubo esté completamente lleno, ciérrelo con un tapón de goma para evitar la formación de burbujas de aire.
   3. En una cámara frigorífica, coloque suavemente los tubos horizontalmente y manténgalos en esta posición durante 2 horas. Pasado este tiempo, endereza lentamente los tubos hasta su posición vertical y ponlos en hielo. Los degradados ya están listos para ser utilizados. Alternativamente, prepare el gradiente de sacarosa del 15-50% utilizando un formador de gradiente convencional.
   4. En una cámara frigorífica, retire con cuidado 1,0 ml de la parte superior del degradado y superponga la sacarosa gota a gota con el lisado citosólico (es decir, el sobrenadante obtenido en el paso 1.2).
   5. Baje con cuidado los tubos en los cubos del rotor del cucharón oscilante. Centrifugar los gradientes durante 100 min a 180.000 x g a 4 °C utilizando una ultracentrífuga.
   6. Después de la centrifugación, deje los tubos en sus cubos durante 20 min a 4 °C para estabilizar los gradientes.
4. Fraccionamiento en gradiente de sacarosa (2 horas)
   1. Retire con cuidado un tubo de ultracentrífuga del rotor de la ultracentrífuga y móntelo en el dispositivo colector de un sistema de fraccionamiento en gradiente de densidad. Recoja fracciones de 1 ml para controlar la absorbancia a 260 nm con un detector UV/VIS (véase Figura 1 panel superior). Mantenga las fracciones recolectadas en hielo.
   2. Prepare alícuotas de 30-40 μl de las fracciones de interés. Manténgalos en hielo antes de almacenarlos a -80 °C hasta su uso. No utilice alícuotas o fracciones de sacarosa que hayan pasado por más de dos ciclos de congelación-descongelación (ver Figura 1 panel inferior).

2. Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica (3 horas)

1. Con cinta adhesiva, retire las hojas de mica.
2. Lave las hojas de mica 3-4 veces con agua DEPC y colóquelas en una placa de Petri pequeña. A continuación, seque la superficie con aire.
3. Cubrir la mica con 200 μl de 1 mM de NiSO₄ e incubar durante 3 min en RT.
4. Retire la solución de níquel y luego seque la superficie con aire. Realice todos los pasos futuros a 4 °C colocando la placa de Petri con la mica sobre hielo.
5. Descongelar una alícuota obtenida en 1.4.2 en hielo y añadir suavemente toda la muestra gota a gota a la mica. Con una punta de 100-200 μl, extienda la muestra por toda la superficie de la mica. Incubar la muestra en hielo durante 3 min.
6. Cubra la hoja de mica gota a gota con 200 μl de Buffer-AFM frío (see Tabla 1) e incube durante 1 hora en hielo.
7. Imágenes en líquido
   1. Retire cuidadosamente el microscopio de fuerza atómica (AFM) y lave las hojas de mica 3-4 veces con 200 μl de tampón-AFM frío para eliminar el exceso de sacarosa. Luego, lave las hojas de mica 3 veces con una solución de lavado fría (ver Tabla 1), dejando la superficie de mica cubierta por algunos microlitros de solución.
   2. Ir al punto 3 (Adquisición de imágenes).
8. Imágenes en el aire
   1. Retire con cuidado el Buffer-AFM y lave la mica 3-4 veces con 200 μl de Buffer-AFM frío para eliminar el exceso de sacarosa. Luego, lave la mica 3 veces con una solución de lavado fría (consulte Tabla 1) y escurra el exceso de agua con papel.
   2. Deje que la muestra se seque bajo la cubierta química con la parte superior de la placa de Petri parcialmente abierta. Después de 2 horas, cierre la placa de Petri y guárdela a temperatura ambiente (RT). Mida la muestra después de 2-3 horas, ya que son estables durante años.

3. Adquisición de imágenes (15 min por imagen después de la estabilización térmica)

Nota: Los polisomas inmovilizados en mica se pueden visualizar en el aire o en líquido utilizando el modo AC.

1. Fije la mica al portamuestras con cinta adhesiva de doble cara.
2. Inserte el portamuestras en la platina AFM siguiendo las instrucciones del fabricante. Si es posible, trate de mantener la muestra a una temperatura inferior a 25 °C para aumentar la estabilidad de los polisomas a tiempo.
3. Seleccione un voladizo adecuado para la generación de imágenes de CA y móntelo en el soporte de la punta siguiendo las instrucciones del fabricante. En este caso, se utilizan voladizos con una constante de fuerza de entre 2 y 20 N/m para la obtención de imágenes de aire y de alrededor de 0,1 N/m para la obtención de imágenes de líquidos.
4. Ajuste el punto láser en el voladizo y ponga a cero las señales del detector de cuadrante.
5. Seleccione una frecuencia de conducción oportuna y conduzca el voladizo con una amplitud de 10-20 nm.
6. Acérquese a la muestra hasta que la punta toque la superficie.
7. Seleccione un área de escaneo de 2x2 μm, adquiera imágenes de al menos 512x512 píxeles (ancho de píxel < 4 nm) y seleccione un modo de sustracción de fondo en vivo y una escala Z de 20-25 nm.
8. Inspeccione la imagen buscando la presencia de objetos redondos caracterizados por la altura entre 10 y 15 nm cuando se adquieren en el aire y 25 y 30 nm cuando están en líquido y el ancho en el rango de 25-30 nm. Ajuste el punto de ajuste y los parámetros de retroalimentación hasta que se visualicen objetos nítidos. El fondo debería aparecer relativamente plano en buenas muestras, con algunos objetos de 2-4 nm de altura (véase Figura 2A y B).
9. Si la imagen se ve bien (como se indica en el punto 3.8), adquiera varios (al menos diez) escaneos de 2x2 micras en diferentes áreas de muestra.
10. (Opcional). Si es necesario, adquiera imágenes de alta resolución de los polisomas seleccionados (véase Figura 2C).
11. Aplique correcciones de software (algoritmos de sustracción de planos y corrección línea por línea) para corregir las imágenes AFM, eliminando los efectos arbitrarios de inclinación y deriva.

4. Análisis de datos (30 min por imagen)

1. Exporte imágenes en ImageJ (opcional: aplique un factor de escala) utilizando preferentemente un formato de compresión sin pérdidas, por ejemplo, el formato TIFF (ver Figura 3A).
2. Utilice el conjunto de herramientas de macros de ImageJ RiboPick.ijm (que se copiará en el subdirectorio de macros/conjunto de herramientas de ImageJ) para contar ribosomas en polisomas (véase, Figura 3B) y calcular las propiedades estadísticas de la muestra (véase Figura 3C).
   1. Comience a cargar una imagen utilizando la herramienta que inicializa el programa.
   2. Elija los centros de los ribosomas con la herramienta estándar ImageJ (shift + clic izquierdo permite la selección múltiple de ribosomas). Marque los ribosomas seleccionados con la herramienta . Las coordenadas del ribosoma aparecerán en una ventana de texto personalizada.
   3. Añadir más ribosomas al mismo polisoma, repitiendo el procedimiento indicado en el punto 4.2.2.
   4. Elimine los ribosomas marcados incorrectamente con la herramienta (comience a eliminar desde el último ribosoma agregado hasta el primero, solo en el polisoma actual).
   5. Cuando se complete el polisoma, utilice la herramienta . A medida que el número de polisoma se agrega como una superposición a la imagen, la ventana de texto se actualiza.
   6. Utilice el para escribir el archivo de coordenadas de ribosoma (se utilizan las unidades predeterminadas de la imagen) y una imagen PNG que resuma los ribosomas y polisomas seleccionados. La imagen original se cierra sin guardarse.

Tabla 1. Búferes.

10 mM Tris–HCl, pH 7.5

Buffer	Composition	Application
Lysis Buffer	Preparación del lisado (1.1)
	10 mM NaCl	{{TAG_ 577}}
	10 mM MgCl2
	{TAG_603}}1% Triton-X100
	1% Na-desoxicolato
	0.0.4 U/ml Inhibidor de la RNasa
{{ TAG_641}}	1 mM DTT
	0.0.0.2 mg/ml de cicloheximida
	{{ TAG_673}}5 U/ml Dnase I
50% solución de sacarosa{{TAG_687 1/TAG_691}} TAG_689	{{}}{{}}50% (p/v) de sacarosa en	Sacarosa Preparación del gradiente (1.2)
	100 mM NaCl {{TAG_717 }}
	10 mM MgCl2{{ TAG_733}}
	10 mM Tris/HCl pH 7.7.5
15% solución de sacarosa	{{ TAG_764}}15% (c/v) de sacarosa en	Preparación del gradiente de sacarosa (1.2)
	100 mM NaCl
10 mM MgCl2
	10 mM Tris/HCl pH 7.º 5
Solución de níquel	1 mM NiSO4	Preparación de muestras para AFM (2)
Buffer-AFM	100 mM NaCl	{{}} Preparación de muestras para AFM (2)
	10 mM MgCl2
	100 μg/ml cicloheximida{TAG_908{ }}
	10 mM Hepes{{ TAG_924}}
	{TAG_935}}3% (p/v) sacarosa pH = 7.7.4
Lavado Solución	DEPC-Agua	Preparación de muestras para AFM (2)
	100 μg/ml cicloheximida {{ TAG_985}}

{{ TAG_548}}{{ TAG_610}}{{ TAG_794}} {{ TAG_824}}

Results

Materials