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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de muestras para exploraciones de microtomografía computarizada (TC)
- Eutanasia de cachorros neonatos en P8 mediante asfixia por dióxido de carbono.
- Realice la perfusión intracardíaca insertando una aguja de calibre 29 con 3 mL de paraformaldehído al 2% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en una jeringa de 10 mL en el ventrículo del corazón del ratón.
PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico; Use la protección adecuada. - Separe la cabeza del cuerpo con unas tijeras. Retire toda la piel de la cabeza con unas tijeras y pegue el cráneo con pinzas para diseccionar todo el cerebro.
- Tome imágenes del cerebro con un microscopio estereoscópico con un aumento de 7,82x, 1x de ganancia, 0,6 gamma y un tiempo de exposición de 20 ms.
- Fije los cerebros disecados con paraformaldehído al 4% en solución de PBS durante la noche.
PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico; Use la protección adecuada. - Al día siguiente, separe los sedesentereros posteriores con pinzas y lávelos con una solución de PBS.
- Incubar los cerebros posteriores en la solución de yodo de Lugol durante 48 h.
- Después de la incubación, seque brevemente al aire los cerebros posteriores para eliminar el exceso de la solución de yodo de Lugol.
- Empaque los cerebros posteriores teñidos de yodo de Lugol en tubos de microcentrífuga de 0,65 ml y selle completamente con una película plástica de parafina para evitar la contracción del tejido (Figura 1A).
- Coloque los tubos de microcentrífuga en tubos de plástico de 5 ml con esponjas para evitar que se muevan durante la exploración (Figura 1B).
2. Micro-CT Exploración de malformaciones cerebrales cavernosas (CCM) en el cerebro del ratón
- Monta verticalmente el cerebro posterior empaquetado en un tubo en un soporte de aluminio en el sistema de micro-CT.
- Ajuste los parámetros de escaneo a 540 proyecciones y un tiempo de exposición de 2 s con condiciones de fuente de 50 kV y 10 W para adquirir los conjuntos de datos tomográficos (resolución de imagen de 9,5 μm/píxel).
- Las radiografías de la exploración se reconstruyen automáticamente mediante un software de reconstrucción de proyección basado en hardware suministrado por el sistema de micro-TC, produciendo una serie de imágenes de cortes axiales de 16 bits (archivo "TXM").
3. Análisis de conjuntos de datos de micro-CT
- Abra el archivo de imagen reconstruido (archivo "TXM") en el software de análisis 3D y visualice el cerebro utilizando la función de "representación de volumen".
- Transforme el cerebro posterior a la orientación deseada utilizando las funciones "cuadro delimitador" y "plano de recorte".
- Vuelva a muestrear la imagen transformada en modo extendido y conserve el tamaño del vóxel.
- Cree "editar nuevo campo de etiqueta" en la imagen transformada (3.3) y resalte solo el cerebro posterior usando la intensidad de la escala de grises.
- Agregue las áreas resaltadas y ejecute el "análisis de etiquetas" para obtener mediciones de todo el cerebro posterior (es decir, , volumen y área totales). Exporte las medidas en un archivo de Excel.
- Visualice el cerebro posterior utilizando la función de "representación de isosuperficie".
- Cree otro "editar nuevo campo de etiqueta" en la imagen transformada y resalte las áreas con lesiones utilizando la intensidad de la escala de grises.
- Agregue las áreas resaltadas y ejecute un análisis de "etiqueta" para obtener mediciones de las lesiones dentro del cerebro posterior (es decir, , volumen total y área). Exporte las medidas en un archivo de Excel.
- Visualice las lesiones utilizando las funciones "generar superficie" y "vista de superficie".
- Tome instantáneas de las imágenes del cerebro posterior en las orientaciones deseadas o genere una película para la visualización en 3D de las lesiones.
