Imágenes de fluorescencia dual para identificar oligodendrocitos diferenciados

Resumen

Fuente: Schott, J. T., et al. Preparación de cultivos progenitores de oligodendrocitos de rata y cuantificación de la oligodendrogénesis mediante escaneo de fluorescencia infrarroja dual. J. Vis. Exp. (2016).

Este video demuestra el uso de imágenes de fluorescencia dual para evaluar la diferenciación de oligodendrocitos de células precursoras (OPC) aisladas del cerebro de una cría de rata. El proceso incluye la fijación de las células, el marcaje de marcadores específicos con anticuerpos primarios y secundarios conjugados con fluoróforos, y su visualización mediante imágenes de fluorescencia. Se identifican oligodendrocitos diferenciados que expresan tanto la proteína básica de mielina (MBP) como el factor de transcripción 2 de oligodendrocitos (Olig2), lo que los distingue de las células precursoras indiferenciadas que solo expresan Olig2.

Protocolo

1. Preparación de placas de ensayo, soluciones madre y medios base OPC

Nota: Los medios de base OPC para ratas (Sato) descritos aquí se han derivado de estudios publicados anteriormente. Las formulaciones de medios alternativos también pueden ser compatibles con este procedimiento.

1. Vuelva a suspender la poli-L-lisina (PLL) hasta una concentración de 10 μg/ml en agua desionizada estéril. Pipetee 400 μl del PLL diluido en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos de paredes negras, fondo transparente.
2. Cubra las placas de cultivo de tejidos durante 2 horas en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C o durante la noche en un refrigerador a 4 °C.
3. Aspire PLL de platos recubiertos al menos 20 minutos antes de enchapar. Deje que el PLL restante se seque del pocillo colocando placas de 24 pocillos con la tapa parcialmente entreabierta en una campana de cultivo de tejidos. Verifique que los pozos estén completamente secos antes de colocar los OPC aislados. Las células no se adherirán al plástico que tenga PLL líquido presente.
4. Prepare N-Acetil-L-cisteína (NAC) (1,000x): Disolver 100 mg N-Acetil-L-cisteína (NAC) en 20 ml del medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Alícuota y almacenar a -20 °C.
5. Prepare la solución madre de hidrocortisona (1,000x): Agregue 1 ml de etanol a 1 mg de hidrocortisona y revuelva para disolver. Añadir 19 ml de DMEM, mezclar la solución, alícuota y almacenar a -20 °C. Se ha demostrado que la adición de hidrocortisona a los medios base mejora la supervivencia de las células gliales.
6. Preparar la solución madre de d-biotina (5.000x): Disuelva 2,5 mg de d-biotina en 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Agregue 1-2 gotas de 5 μl de NaOH 0,1 N para ayudar en la disolución. Alícuota y almacenar a -20 °C.
7. Prepare la solución madre de insulina (100x): Disuelva 25 mg de insulina en 50 ml de agua apta para cultivo de tejidos. Agregue 250 μl de HCl 1 N y mezcle hasta que la solución esté clara. Esterilizar con un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 °C durante un máximo de 6 semanas.
8. Prepare la solución madre de Sato (100x):
   1. Prepare la solución madre de progesterona (25 μg/μl): Disuelva 2,5 mg de progesterona en 100 μl de etanol.
   2. Preparar la solución madre de selenito de sodio (400 ng/μl): Disuelva 4 mg de selenito de sodio en 100 μl de NaOH 0,1 N. Añadir 10 ml de DMEM y mezclar.
   3. A 100 ml de DMEM, añadir 1 g de apo-transferrina humana, 1 g de albúmina sérica bovina y 160 mg de putrescina y mezclar hasta que se disuelva completamente. Agregue 25 μl de solución madre de progesterona, 1,000 μl de solución madre de selenito de sodio y mezcle. Alícuota y almacenar a -20 °C.
9. Prepare el medio base OPC: por 100 ml de DMEM (con 4,5 g/L de D-glucosa, L-glutamina y 110 mg/L de piruvato de sodio), agregue 100 μl de NAC, 100 μl de hidrocortisona, 20 μl de d-biotina, 1 ml de insulina, 1 ml de caldo Sato, 100 μl de oligoelementos B, 2 mL de suplemento B-27 (50x) y 1 ml de penicilina/estreptomicina (100x). Esterilizar con un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 °C.
10. Prepare la solución madre del factor de crecimiento AA DERIVADO DE PLAQUETAS (PDGF-AA) (1.000x): Disuelva 250 μg en 12,5 ml de PBS con albúmina sérica bovina (BSA) al 0,1% para hacer una solución de 20 μg/ml. Alícuota y almacenar a -80 °C.
11. Prepare los medios de proliferación OPC: Medios base OPC suplementados con 20 ng/ml de PDGF-AA.
12. Preparación de medios de diferenciación OPC: medios base OPC suplementados con triyodotironina de 45 nM.
13. Preparar el tampón de columna: A 500 ml de PBS, añadir 2,5 g de BSA y 2 ml de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 M y ajustar el pH a 7,2. Esterilizar con un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 °C.

2. Inducción de la diferenciación y fijación de OPC con paraformaldehído al 4%

Nota: Al probar el efecto de moléculas pequeñas en la oligodendrogénesis, disolvemos rutinariamente los fármacos en dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar 1.000x stocks que luego pueden almacenarse a -80 °C y diluirse directamente en medios SATO para obtener una concentración final del 0,1% DMSO. No hemos observado cambios en la proliferación o diferenciación de OPC utilizando esta concentración de DMSO (datos no mostrados).

1. Precaliente los medios base OPC a 37 °C y descongele las existencias de tratamiento de medicamentos a temperatura ambiente. Al realizar tratamientos por duplicado, prepare aproximadamente 1,25 ml de medios por grupo de tratamiento en un tubo de 1,5 ml. Para muestras triplicadas, utilice tubos de centrífuga de 2 ml de capacidad para tener en cuenta la holgura.
2. Prepare las mezclas maestras de tratamiento para pozos replicados diluyendo las existencias de tratamiento directamente en los medios base OPC. Mezcle brevemente o mezcle suavemente cada mezcla maestra para garantizar una distribución homogénea del tratamiento.
3. Prepare triyodotironina 45 nM (T₃) como control positivo y el vehículo apropiado como control negativo. Diluir 10 mM T₃ stock 1:1.000 en 1 ml de medio base OPC y luego diluir aún más en la mezcla maestra de tratamiento para reducir la concentración final de DMSO si es necesario.
4. Aspire los medios de los pocillos de cultivo, un grupo de tratamiento a la vez, para evitar que las células se sequen. Utilice una punta de pipeta de 200 μl en el extremo de la pipeta Pasteur de vidrio para evitar raspar el material negro de los lados del pocillo y meterlo en el cultivo.
5. Agregue lentamente 500 μl de mastermix de tratamiento a lo largo del costado del pocillo con una pipeta de 1 ml.
6. Incubar los cultivos durante el período de tiempo deseado, realizando un intercambio completo de medios con medios de tratamiento frescos cada 2-3 días. Observamos rutinariamente un cultivo de 30-40% de MBP⁺ después de 4 días en medios de diferenciación.
7. Al final del período de tratamiento deseado, prepare paraformaldehído (PFA) fresco al 4% o descongele un caldo congelado a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: El PFA es extremadamente tóxico y debe prepararse en una campana extractora.
8. Aspire el medio y agregue lentamente 400 μl de PFA al costado del pocillo para fijar las celdas. Incubar la placa durante 20 min a temperatura ambiente.
9. Aspire el PFA y agregue lentamente 500 μl de solución salina estéril tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS, con Ca²⁺ y Mg²⁺) al lado del pozo para lavar las células. Repite el lavado un total de dos veces más. No aspire el lavado final.
10. Envuelva la placa en parafilm y guárdela a 4 °C para su posterior procesamiento o proceda directamente al siguiente paso. Las placas se pueden almacenar durante varias semanas.

3. Inmunocitoquímica y cuantificación de la proteína básica de mielina

Nota: Al realizar procedimientos de manejo de líquidos en las placas de 24 pocillos, se recomienda trabajar rápido para evitar secar las celdas. En este caso, se recomienda el uso de un aspirador de vacío multicanal y una pipeta multicanal.

1. Lleve la placa a temperatura ambiente, aspire los pocillos y agregue 250 μl de D-PBS (con Ca²⁺ y Mg²⁺) que contiene 0,1% de Triton X-100 y 5% de suero de cabra normal (NGS). Incubar la placa a temperatura ambiente durante 1 hora con una suave agitación orbital.
2. Prepare la solución de incubación primaria diluyendo el anticuerpo monoclonal anti-MBP de ratón 1:1.000 y el anticuerpo policlonal anti-actina de conejo 1:200 en D-PBS (con Ca²⁺ y Mg²⁺) que contienen un 5% de NGS. Alternativamente, el anti-Olig2 policlonal de conejo a 1:1.000 se puede utilizar para la normalización específica de oligodendrocitos en cultivos gliales mixtos. Prepare suficiente solución primaria para acomodar 250 μl por pocillo.
3. Incubar los anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche durante 16-18 horas con una suave agitación orbital.
4. Aspirar la solución de incubación primaria y lavar las células 3 x 10 min con 500 μl de D-PBS (con Ca²⁺ y Mg²⁺) a temperatura ambiente con una suave agitación orbital.
5. Mientras lava la placa, prepare la solución de incubación secundaria diluyendo los anticuerpos anti-ratón 680 y anti-conejo 800 1:500 en D-PBS (con Ca²⁺ y Mg²⁺) que contienen un 5% de NGS. Minimice la exposición a la luz ambiental al preparar esta solución.
6. Aspirar el lavado final y añadir 250 μl de solución de incubación secundaria. Proteja la placa de la luz e incubela a temperatura ambiente durante 1 hora con una suave agitación orbital.
7. Aspirar la solución de incubación secundaria y lavar los pocillos 3 x 10 min con 500 μl de D-PBS (con Ca²⁺ y Mg²⁺) a temperatura ambiente con una suave agitación orbital.
8. Escanee la placa utilizando un sistema de imágenes capaz de detectar emisiones de fluorescencia de 700 nm y 800 nm. Como punto de partida, establezca el desplazamiento focal en 3 y las sensibilidades en 1,5 para MBP, 5,0 para Actin y 3,5 para Olig2. Ajuste los valores de sensibilidad según sea necesario para evitar la sobreexposición de la señal.
9. Cuantificar el alcance de la oligodendrogénesis utilizando métodos semiautomatizados basados en software.
   1. Con el software, configure el modo de análisis de placas en "24 pozos" y alinee círculos alrededor del perímetro exterior de los pozos escaneados. Establezca el canal de normalización en "800" y exporte las intensidades de fluorescencia totales y relativas para los canales de 700 nm (MBP) y 800 nm (Olig2/Actina).
   2. Divida la intensidad a 700 nm por la intensidad a 800 nm para obtener la expresión normalizada de MBP en unidades de fluorescencia relativas. Calcule el promedio de las mediciones replicadas y escale la expresión a los controles Día 0 +PDGF según sea necesario para el análisis.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Culture Materials
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/mL
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 mL
Triyodotironina	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
Clemastine fumarato salt	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μM
Quetiapine hemifumarate salt	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μM
N-acetil cisteína	Sigma-Aldrich	A9165	5 μg/mL
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/mL
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524	10 μg/mL
Putrecine	Sigma-Aldrich	P7505	16 μg/mL
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/mL
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/mL
d-Biotin<	B4639	10 ng/mL<
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	5 μg/mL
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1147	100 μg/mL
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A4161	100 μg/mL
Trace Elements B	Corning	25-022-Cl	1 x
B-27 Supplement	Life Technologies	17504044	1 x
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140122	1 x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1 x
24-well Black Visiplate con tapa	Perkin Elmer	1450-605	Tissue culture grade
Immunocytochemistry and Quantification
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
Normal Goat Serum	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
mouse monoclonal anti-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1000 Dilución
rabbit polyclonal anti-Actin<	SC-7210	1:200 Dilution
conejo policlonal anti-Olig2	Millipore	AB9610	1:1000 Dilution
goat anti-mouse 680RD	Licor	926-68070	1:500 Dilution
goat anti-rabbit 800CW	Licor	926-32211	1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11032	1:000 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit	Life Technologies	A11008	1:000 dilution
Prolong Gold antifade with DAPI	Life Technologies	P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System	Licor

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