Visualización de las mitocondrias dentro de las fibras nerviosas intraepidérmicas

Resumen

Fuente: Hamid, H. S., et al. Imágenes tridimensionales y análisis de mitocondrias dentro de fibras nerviosas intraepidérmicas humanas. J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra el método para visualizar mitocondrias específicas del nervio utilizando imágenes tridimensionales. Describe el proceso de adquisición de escaneos secuenciales de fibras nerviosas intraepidérmicas premarcadas y la generación de imágenes de superficie en 3D para aislar y mostrar las mitocondrias en relación con las estructuras nerviosas.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las pautas del IRB del instituto.

1. Imágenes confocales

1. Realizar imágenes confocales:
   1. Recopile imágenes utilizando un microscopio confocal de barrido láser con un objetivo de inmersión en aceite de 40X (apertura numérica (N.A.)) en un microscopio invertido.
      1. En cada plano focal, adquiera secuencialmente señales fluorescentes:
         Núcleos: excitación λ = 405 nm, filtro de emisión espectral λ = 420 - 480 nm
         Fibras nerviosas: excitación λ= 488 nm, filtro de emisión espectral λ = 505 - 560 nm
         Mitocondrias: excitación λ = 543 nm, filtro de emisión espectral λ= 606 - 670 nm
   2. Introduzca los siguientes parámetros de escaneo en el software del microscopio: velocidad de escaneo de 600 Hz con un promedio de 2 fotogramas y un zoom de 2,2; Resolución de intensidad de 12 bits (4096 niveles de gris).
      1. Configure el software del microscopio para optimizar la resolución lateral (resolución de escaneo = 1.024 x 1.024) y la resolución axial/corte óptico (apertura confocal = 1 unidad de aire (UA) con un tamaño de paso z de 210 nm).
         NOTA: La resolución XYZ resultante es de 172,2 nm x 172,2 nm x 210 nm con un tamaño de imagen de 176,1 μm x 176,1 μm x 30-50 μm.
   3. Active un escaneo en vivo para la señal nerviosa (fluorescencia verde) y ajuste el Control de enfoque Z para encontrar y establecer los planos focales superior e inferior en el software del microscopio que abarcan la señal nerviosa dentro de la sección de tejido. El rango z total suele ser de 30-50 μm para una sección de tejido de 50 μm.
   4. Gire el campo de escaneo con el software del microscopio durante un escaneo en vivo para que la epidermis se coloque horizontal o verticalmente en la imagen.
   5. Escanee cada señal por separado y ajuste el voltaje y la compensación del detector (tubo fotomultiplicador, PMT) para minimizar/eliminar los píxeles saturados por encima y por debajo.
      NOTA: Los tiempos de escaneo con los parámetros anteriores toman aproximadamente 20 a 40 min, dependiendo del número de cortes z.

2. 3D Visualización y análisis de mitocondrias dentro de las fibras nerviosas intraepidérmicas humanas

1. Aislar la epidermis 3D:
   1. Duplique la imagen original y utilice la proyección de máxima intensidad (vista de enfoque extendida) de la imagen para identificar y aislar la epidermis.
   2. Utilice una herramienta de región de interés para trazar a lo largo de los bordes superior e inferior de la epidermis para eliminar las áreas no deseadas, como el estrato córneo y la dermis, que están ausentes de fibras nerviosas intraepidérmicas. Recorte a esta selección.
2. Utilice la deconvolución en las señales fluorescentes nerviosas y mitocondriales:
   NOTA: La deconvolución ayuda a restaurar la integridad de las señales fluorescentes. La restauración utilizada en este protocolo se denomina deconvolución ciega porque utiliza las señales fluorescentes de las imágenes para determinar cuánto se propagan las señales desde su fuente original (función de dispersión puntual). El proceso mejora la resolución de la señal al reasignar la dispersión de la señal a su ubicación de origen.
   1. Calcule una función de dispersión puntual (PSF) para la señal del nervio fluorescente verde (fluorescencia verde) con los siguientes parámetros:
      1. Establezca PSF calculado en confocal. Establezca el índice de refracción medio en 1,515 y la apertura numérica en 1,25. Ajuste el orificio del detector a 1 UA. Establezca la longitud de onda de excitación del láser en 488 nm y la longitud de onda de emisión en 515 nm.
   2. Calcule un PSF para la señal mitocondrial fluorescente roja (fluorescencia roja) con los siguientes parámetros:
      1. Establezca el PSF calculado en confocal. Establezca el índice de refracción medio en 1,515 y la apertura numérica en 1,25. Ajuste el orificio del detector a 1 UA. Establezca la longitud de onda de excitación del láser en 543 nm y la longitud de onda de emisión en 617 nm.
   3. Optimice las señales fluorescentes de los nervios y las mitocondrias mediante la deconvolución utilizando los PSF correspondientes enumerados anteriormente y la función de restauración iterativa establecida al 100 % de confianza y un límite de iteración de 10 ciclos.
3. Crear superficies específicas de nervios:
   1. Utilice la herramienta "crear superficie" para crear una superficie sólida de los nervios a partir del etiquetado secundario verde fluorescente desconvolucionado de los nervios identificados con el producto génico de la proteína 9.5 (PGP9.5).
   2. Desmarque la función "suave" y use la función de intensidad absoluta para establecer el umbral de la señal nerviosa, ya que es significativamente más brillante que la fluorescencia de fondo.
   3. Utilice la función de intensidad absoluta para establecer el umbral de la señal nerviosa, ya que es significativamente más brillante que la fluorescencia de fondo. Establezca un valor umbral lo suficientemente bajo como para identificar con precisión los nervios.
   4. Filtre las superficies pequeñas que no sean nerviosas en función del tamaño.
      NOTA: Si es necesario, edite manualmente superficies adicionales que no sean nervios dentro de la pestaña "Editar" manteniendo presionada la tecla CONTROL para resaltar varios objetos y luego elimínelos con la tecla Suprimir.
4. Aísle la señal mitocondrial fluorescente específica del nervio:
   1. Seleccione la pestaña Editar de la superficie del nervio para ver la función "Propiedades de la máscara". La superficie nerviosa creada se utiliza para aislar las mitocondrias dentro de esos nervios, lejos de las señales mitocondriales asociadas con los queratinocitos.
   2. Como el botón "Enmascarar todo" abre una ventana de "Enmascarar canal", elija la señal roja fluorescente desconvolucionada en el menú desplegable bajo "Selección de canal" para la señal mitocondrial.
   3. Haga clic en el cuadro para poner una marca de verificación en la opción "duplicar canal antes de aplicar la máscara".
   4. Haga clic en el botón de opción frente a la opción "Constante interior/exterior" de la Configuración de máscara y haga clic en el cuadro para poner una marca de verificación en la opción "Establecer superficie exterior de vóxel en" y escriba 0.00 para el valor. Haga clic en el botón Aceptar para crear el nuevo canal que representa las señales mitocondriales dentro de la superficie del nervio.
5. Crear superficies específicas de mitocondrias:
   1. Utilice la herramienta "crear superficie" para crear una superficie sólida de las mitocondrias a partir del canal fluorescente recién creado de las señales mitocondriales específicas del nervio.
   2. Desmarque la función "suave" y seleccione la función "sustracción en segundo plano" para establecer el umbral. Esta característica utiliza el contraste local alrededor de la señal mitocondrial para identificar las mitocondrias desde el fondo.
   3. Establezca el valor umbral lo suficientemente bajo como para identificar las mitocondrias con precisión. En este ejemplo, el umbral inferior se estableció en 2.000 para una escala de 16 bits (65.536).
   4. Filtre las superficies mitocondriales en función del tamaño. En este ejemplo, el límite de vóxeles se estableció en 1,0 vóxeles, que es el límite más bajo posible. Si es necesario, edite manualmente las superficies que no sean mitocondrias dentro de la pestaña "Editar" manteniendo presionada la tecla CONTROL para seleccionar varios objetos y luego elimínelos con la tecla Eliminar.
      NOTA: Ocasionalmente, el software creará superficies que no están asociadas con una señal mitocondrial fluorescente distinguible. En estos casos, es posible eliminarlos con la pestaña "Editar".

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio confocal de barrido láser Leica SP5	Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL	SP5
Volocity x64 software	Perkin Elmer, Waltham , MA	Versión 4.4.0	El software Volocity se utiliza para el procesamiento de imágenes
Imaris x64 software de análisis 3D{{TAG_ 31}}	Bitplane, Concord, MA	Versión 7.7.1	El software Imaris se utiliza para el análisis de imágenes