Imágenes de calcio ex vivo para estudiar las respuestas cerebrales de Drosophila a los neuropéptidos

Resumen

Fuente: Ishimoto, H. et. al., Imágenes de calcio ex vivo para visualizar las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra las imágenes de calcio para estudiarDrosophila respuestas cerebrales a los neuropéptidos. Las neuronas que expresan un indicador de calcio fluorescente revelan la dinámica del calcio intracelular y las respuestas funcionales a las moléculas de señalización.

Protocolo

1. Preparación de explantes de cerebro de larva

1. Haga una cámara de imágenes.
   NOTA: La grabación estable requiere que los explantes cerebrales estén atados. Aquí, se utiliza una cámara de imágenes de bajo costo hecha a mano en el sistema de imágenes Ca²⁺.
   1. Con pinzas, rasque el centro inferior de una placa de cultivo de plástico (35 mm x 10 mm) para crear una abolladura para el ganglio ventral del cerebro de la larva, lo que facilita el montaje (paso 1.3, Figura 1).
   2. Con un palillo, coloque una pequeña gota de superpegamento a cada lado de la abolladura y fije una varilla de tungsteno (0,125 mm de diámetro, 6 a 7 mm de longitud) al pegamento.
   3. Usando un pequeño trozo de adhesivo reutilizable similar a la masilla, haga una pared circular (10 mm de diámetro y 3 mm de alto) alrededor de la abolladura (Figura 1).
      NOTA: El espacio dentro de la pared se llenará posteriormente con solución salina tamponada con fosfato (PBS; 0,14 M cloruro de sodio (NaCl), 0,0027 M cloruro de potasio (KCl), 0,01 M ion fosfato (PO4^3–), pH 7,4 ± 0,05 a 25 °C).
2. Preparación animal
   NOTA: Para las imágenes de calcio, un indicador de calcio, GCaMP6s, se expresa en el tipo de célula de interés, que se logra comúnmente utilizando combinaciones de GAL4 específicos de tejido y UAS-GCaMP6s. Para asegurar que la señal es mediada a través del receptor candidato, GCaMP6s también se expresa en un mutante defectuoso en el receptor.
   1. Cuando se requieren comparaciones experimentales para diferentes genotipos, como el tipo salvaje y los mutantes, la edad de las larvas de prueba para evitar las variaciones en el nivel de expresión de GCaMP6 y las diferencias fisiológicas debidas a las etapas de desarrollo.
   2. Mantenga las moscas parentales (30 moscas para cada sexo) en un vial de cultivo que contenga alimento estándar para moscas durante 8 horas para permitir la puesta de huevos en la superficie del alimento. Cultivar larvas en masa bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h a 25 °C y 60-70 % de humedad relativa.

3. Disección del cerebro de las larvas
   1. A las 90-120 h después de la puesta de huevos (AEL), recoja las larvas y lávelas al menos 3 veces con agua destilada para eliminar los restos de comida adherentes.
   2. Coloque una larva en un vidrio de reloj cuadrado de 1.5 pulgadas lleno de PBS helado.
      NOTA: Los siguientes dos pasos se llevan a cabo en este cristal de reloj bajo el microscopio de disección.
   3. Use fórceps para agarrar suavemente la parte media de la larva. Use otra pinza para agarrar los ganchos bucales y tire de los ganchos bucales suavemente para separar la parte anterior de la larva que contiene el cerebro del resto del cuerpo.
      NOTA: Alternativamente, se pueden usar tijeras quirúrgicas.
   4. Sostenga la punta anterior con pinzas y voltee la larva al revés. Extirpar el tejido extraño adherido al cerebro, como los discos imaginales, los cuerpos grasos y las glándulas anulares. Separe suavemente el cerebro de las piezas bucales.
   5. Aplique 200 μL de PBS en el interior del anillo hecho del adhesivo reutilizable similar a la masilla en la cámara de imagen. Succionar suavemente el cerebro diseccionado con PBS en una pipeta Pasteur y luego transferirlo a la cámara de imágenes.

4. Colocación del cerebro en la cámara de imágenes
   1. Use fórceps para agarrar las fibras musculares que se extienden desde los ganglios ventrales. Inserte el cerebro suavemente en la abolladura debajo del alambre de tungsteno.
   2. Con otra pinza, tire del alambre de tungsteno ligeramente hacia arriba para colocar el cerebro en la posición correcta para la obtención de imágenes (Figura 1).

2. Adquisición de Ca²⁺ Imágenes de fluorescencia

NOTA: Los explantes cerebrales inmersos en PBS se obtienen imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con una lente objetivo de inmersión en agua de 20X (apertura numérica, N.A. = 0,5). El PBS no activa las células del cerebro. Si se necesitan imágenes del eje Z, la lente del objetivo se monta con un motor de lente activado por piezoeléctrico. Se utiliza una cabeza confocal de disco giratorio para mejorar la resolución del tiempo. Para la obtención de imágenes con poca luz, se monta en el microscopio una cámara de dispositivo de carga acoplada que multiplica electrones. La obtención de imágenes de la fluorescencia de GCaMP6s (excitación/emisión: 488/509 nm) requiere un láser de 488 nm para la excitación con un divisor de haz dicroico y un filtro de emisión (e.g., 528 ± filtro de paso de banda de 38 nm).

1. Coloque la cámara de imágenes que contiene el explante de cerebro bajo el microscopio.
2. Baje la lente del objetivo hasta que toque el PBS. Bajo iluminación de campo claro, coloque el cerebro y consúltelo. Cambie a luz fluorescente y ajuste el enfoque en las celdas marcadas con GCaMP6s.
   NOTA: La fluorescencia verde basal de los GCaMP6s debería ser visible.
3. Inicie la adquisición a 250 ms/fotograma a una resolución de 512 × 512 píxeles en modo refrigerado por agua utilizando el software de adquisición adecuado (e.g., μManager). Ajuste el tiempo de exposición para obtener valores de fluorescencia dentro del rango dinámico de la cámara con dispositivo de carga acoplada (CCD), pero no inferior a 1000 (unidades arbitrarias), con imágenes de 16 bits (rango dinámico de 0 a 65 535).
   NOTA: Se debe utilizar un tiempo de exposición bajo para minimizar el fotoblanqueo de los GCaMP6s. El tiempo de exposición debe optimizarse en cada experimento, ya que depende de los niveles de expresión de GCaMP6 y de la sensibilidad del sistema de detección. Fueron 100 ms en nuestro experimento usando dilp2>GCaMP6s. Cuando se requieren secciones z para una profundidad de imagen determinada, se pueden adquirir varias imágenes de sección z en función del tiempo de exposición y los intervalos de fotogramas. Si la cámara tiene suficiente resolución espacial, se debe aumentar el tamaño de agrupación (número de registros en el chip que se agruparán en un píxel digital) para reducir el tiempo de exposición.
4. Una vez determinados los parámetros de imagen, se deben tomar imágenes durante 1 minuto antes de la administración del péptido para detectar las intensidades de señal basales (F₀).
5. Aplique el péptido de prueba; para ello, disuelva 100 μL de solución peptídica en PBS y pipetee directamente en el baño larvario para obtener una concentración óptima.
   NOTA: La solución peptídica debe inyectarse lentamente (p. ej., caudal de 20 μL/s) en la solución de baño utilizando una pipeta. Un péptido sintético no relacionado disuelto en PBS se utiliza como control negativo.
6. Grabe la emisión de GCaMP6s durante unos minutos.

Resultados

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tungsten rod	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000
Blu Tack	Bostik, París, Francia	3049100	Adhesivos reutilizables tipo masilla
Watch glass, square, 1 5/8 in	Carolina Biological Supply Company, Burlington, Carolina del Norte, EE. UU. style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Arial;font-size:10pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;text-align:center;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japón	T900	Sales tamponadas fosfatadas
CCHa2	SCRUM Inc., Tokio, Japón		Custum-synthesized peptide
Ghrerin	Peptide institute Inc., Osaka, Japón	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., Osaka, Japón style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Arial;font-size:10pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;text-align:center;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Axio Imager A2	Fluorescence microscope
Objetivo W N-achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	420957-9900-000<
P-725 Escáner de objetivos PIFOC con largo recorrido de alcance	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Alemania	N/A	Movimiento de lentes activado por piezoeléctrico
Unidad de escáner confocal CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokio, Japón style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Arial;font-size:10pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;text-align:center;vertical-align:bottom; white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>CSU-W1	Cabeza confocal de disco giratorio
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japón	C9100-13	EM-CCD camera
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA	1178770	488-nm laser
488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	Divisor de haz dicroico
528/38 nm BrightLine single-band band pass filter	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	Filtro de emisión
μManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org

td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Arial;font-size:10pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Lente de objetivo de inmersión en agua