$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Extracción de cerebro, seccionamiento y preparación de tejidos
- Sacrifique la cepa de ratón de tipo salvaje C57BL/6 mediante la eutanasia profunda con CO2 asfixia durante 5 min. Asegurar la muerte por luxación cervical.
- Limpie la cabeza del ratón con etanol al 70%.
- Realice la craneectomía con tijeras y pinzas estériles tirando primero de la piel, comenzando por la parte superior de la cabeza para exponer el cráneo.
- Luego, cuando el cráneo esté expuesto, extraiga el cráneo pelando el hueso pieza por pieza, comenzando desde el lado posterior y moviéndose hacia el lado anterior. Tenga cuidado de no destruir los ventrículos cerebrales.
- Recoge todo el cerebro.
- Coloque el cerebro en una placa de Petri de 100 mm que contenga Dulbecco's Modified Eagle ́s Medium (DMEM)/High-Glucose suplementada con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina solución que contenga 10.000 unidades/ml de penicilina y 10.000 μg/ml de estreptomicina y precalentada a 37 °C.
- Corta el cerebro en el plano sagital medio a mano con un cuchilla afilada, y use un vibratomo para obtener la primera sección de 100-200 mm de cada mitad.
- Enjuague el tejido cerebral con una solución salina tamponada con fosfato precalentada a 37 °C (1x PBS).
- Coloque inmediatamente la sección del cerebro en un medio DMEM/alto contenido de glucosa precalentado a 37 °C.
2. Configuración y configuración de imágenes en vivo
- Coloque las secciones de tejido cerebral en placas de cultivo de 30 mm con fondo de vidrio que contengan 1 ml de medios DMEM/alta glucosa. Ajuste el entorno de la cámara cerrada del microscopio a 37 °C, 95%/5% O2/CO2 contenido (Figura 1).
- Con una lente de inmersión en aceite de objetivo de 60X, recoja las imágenes de células ependimarias/cilios colocando una gota de aceite en la lente de objetivo de 60X y enfocándose en las celdas con luz transmitida regular por contraste de interferencia diferencial (DIC).
- Luego, siga la dirección del movimiento de la burbuja DMEM como guía para la ubicación de los cilios ependimarios móviles, ya que los latidos ciliares crean una especie de movimiento de burbuja en el área. Elija un área que contenga células sanas con cilios móviles en el ventrículo lateral del cerebro utilizando el filtro CID. Una vez encontrados los cilios ependimarios, se ajusta la luz y el enfoque para obtener una imagen satisfactoria.
- Con el software de imágenes Metamorph, configure los parámetros de imágenes en vivo de acuerdo con un propósito específico. En la presente demostración, adquiera imágenes de veinticuatro bits con el agrupamiento de la cámara configurado en 1 x 1 combinado con un objetivo de 60X y un tiempo de exposición de 5-10 ms.
- Recoja las imágenes DIC abriendo la apertura del microscopio a un nivel óptimo para un tiempo de exposición mínimo. Observe las imágenes en vivo transmitidas a la cámara para proporcionar una adquisición de imágenes rápida e inmediata sin demora. Calcule la velocidad de batido de los cilios en función de los requisitos de los tiempos de exposición mínimos para obtener suficiente contraste de imagen.
