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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Preparación de tejido cerebral e imágenes SBFSEM
- Anestesiar a un ratón negro C57 joven (~2 - 4 meses de edad) (cepa C57BL/6J) utilizando isoflurano al 4 - 5% siguiendo las pautas institucionales. Confirme la anestesia controlando la pérdida de tono muscular, la falta de movimientos voluntarios y las respuestas a estímulos aversivos como un pellizco en la cola.
- Sujete el ratón en una bandeja de disección y haga una incisión en la piel a lo largo de la línea media ventral. Haz más incisiones en la piel para exponer la caja torácica del ratón. Haga una incisión en el diafragma, diseccione cuidadosamente la cavidad torácica a lo largo de la periferia para exponer el corazón que late y luego haga una incisión en la aurícula derecha.
- Con una cánula de mariposa, cánula el ventrículo izquierdo. Perfundir el ratón por vía transcardíaca con 10 - 20 ml de solución salina tampón fosfato (PBS) pH 7,2, hasta que se confirme la exanguinación por un cambio en el color del hígado.
Nota: Un cambio en el color del hígado se utiliza como guía para determinar el grado de exanguinación. Confirme que el color del hígado cambia de marrón rojizo a rosa pálido. - Perfundir el ratón por vía transcárdica utilizando 10 - 20 ml de glutaraldehído al 2% y paraformaldehído al 4% en tampón de cacodilato 0,10 M (pH 7,2), para fijar el tejido cerebral rápidamente desde dentro. La fijación se controla observando el endurecimiento de la cola.
Nota: Prepare un tampón de cacodilato de 0,10 M (pH 7,2) disolviendo 2,14 g de cacodilato de sodio en 80 ml de agua, agregue ácido clorhídrico para ajustar el pH y haga el volumen a 100 ml con agua. - Después de la perfusión, decapitar al ratón, diseccionar el cerebro, seguido de la fijación en tampón de cacodilato de sodio 0,10 M (pH 7,2) que contiene 2% de glutaraldehído y 4% de paraformaldehído durante 48 horas a 4 oC.
- Después de 48 horas, haga secciones coronales de 400 μm usando un vibratomo y luego diseccione cuidadosamente la región de interés en el cerebro (por ejemplo, el hipocampo) bajo el microscopio de disección. Recorte con cuidado el pañuelo y tome una fotografía para preservar la orientación.
Nota: Los métodos de posprocesamiento de la tinción de tejidos en SBFSEM combinan una variedad de métodos de tinción de metales pesados para mejorar la resolución. . - Lavar los tejidos fijados con glutaraldehído 3 veces, 5 min cada uno, en tampón de cacodilato 0,1 M (pH 7,2).
- Prepare una solución de ácido tánico al 0,1% disolviendo ácido tánico en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,2). Agite hasta que se disuelva y filtre a través de un filtro de 0,45 μm, si es necesario.
- Postfije los tejidos con ácido tánico tamponado al 0,1% de cacodilato incubándolos en 1 ml de reactivo durante 30 - 60 min en RT.
Nota: El tiempo de incubación depende del tamaño del tejido, pero 30 min funciona mejor para la mayoría de los tejidos. - Lave los pañuelos 3 veces, 5 min cada uno, en tampón de cacodilato (pH 7,2).
- Disuelva 0,3 g de ferrocianuro de potasio y 0,86 g de cacodilato de sodio en 10 ml de H destilado2O (dH2O). Mantenga la solución de ferrocianuro de potasio en hielo. Justo antes de usar, añadir 10 ml de tetróxido de osmio al 4% (OsO4).
- Teñir los pañuelos con una solución de osmio-ferrocianuro al 2% durante 90 min, en hielo. Lavar 3 veces, 5 min cada una en dH2O.
- Prepare una solución de tiocarbohidrazida (TCH) al 1% disolviendo 0,1 g de TCH en 10 ml de dH2O. Disolver a 60 °C agitando cada 10 min hasta que se disuelva por completo. Observe las precauciones de seguridad al manipular el TCH, en particular teniendo cuidado de evitar el uso de metales, el calentamiento a altas temperaturas o permitir que la solución se seque.
- Tratar las muestras con TCH al 1% recién preparado durante 20 min en RT. Lavar 3 veces, 5 min cada una, en dH2O.
- Diluir al 4% OsO4 al 2% con dH2{{TAG_ 196}}O, y tiñe los tejidos con tetróxido de osmio acuoso al 2% incubándolos durante 1 hora. Lave los pañuelos 3 veces, 5 minutos cada uno, con dH2O.
- Incubar las muestras O/N en acetato de uranilo al 1% en dH2O a 4 °C.
- {{TAG_ 222}}Prepare la solución de aspartato de plomo de Walton.
- Disuelva 0,998 g de L-aspartato en 250 ml de dH2O y luego agregue 10 N de hidróxido de potasio (KOH) gota a gota hasta que el pH alcance 5,5. Después de ajustar el pH, añadir 0,066 g de nitrato de plomo en 10 ml de caldo de ácido aspártico y calentar a 60 °C durante 30 min.
- Enjuague los pañuelos en dH2O e incube con la tinción de aspartato de plomo de Walton durante 30 min en un horno a 60 °C. Lavar 3 veces, 5 min cada una, en dH2O.
- Deshidrate las muestras a través de una serie graduada de alcohol utilizando soluciones enfriadas de etanol al 20%, 50%, 75%, 85,% y 95% durante 5 min cada una, seguido de etanol al 100% 3 veces, 10 min cada una.
Nota: Utilice etanol al 100% de botellas recién abiertas, ya que el etanol abierto absorbe agua del aire y hace que la incrustación falle. Serán necesarias incubaciones más largas con muestras de tejido más grandes. - Lave las muestras 2 veces, 15 min cada una, en óxido de propileno.
- Haga resina de inclusión de plástico con 25 ml de resina, 10,5 ml de DDSA (anhídrido dodecenil succínico), 15,5 ml de NMA (anhídrido de metilo nádico) y 1 ml de DMP-30 (2,4,6-Tris dimetilaminometil fenol). Mezclar la resina agitando. Gira y deja reposar la resina hasta que se asienten las burbujas.
Nota: Esta es la receta estándar de dureza media. Se pueden usar otros tipos de resina plástica de microscopía electrónica (EM), pero deben probarse con una muestra de control no esencial por adelantado, ya que no todas las resinas funcionan para SBFSEM. - Incubar los tejidos O/N en una mezcla 50:50 de resina de inclusión y óxido de propileno en un vial que se tapa inicialmente y se destapa después de 2 horas para que el óxido de propileno se evapore durante un período de aproximadamente 8 a 10 horas.
- Transfiera los tejidos a resina de inclusión 100% fresca en viales limpios durante 2 horas.
{{TAG_ 306}}Incrustar muestras en resina de incrustación fresca, en moldes planos que contengan etiquetas de papel impresas, y curarlas en un horno a 60 °C durante 48 horas. Después de aproximadamente 1 hora, verifique la colocación y alineación del tejido nuevamente y ajústelo si es necesario. - Recorte las muestras hasta el área de interés y móntelas en un pin de aluminio con superpegamento gelificante de cianoacrilato o una resina epoxi conductora. Luego, cubra los lados del bloque con pasta de plata coloidal para proporcionar un camino conductor al pin de aluminio.
- Examine muestras de tejido utilizando un sistema de microscopio electrónico de barrido equipado con una etapa de ultramicrótomo en la cámara y un detector de electrones retrodispersados de bajo kV.
Nota: Obtenga capacitación sobre el uso de instrumentos y sitios en el uso de microscopía electrónica de barrido (SEM) y conviértase en un usuario autorizado. Alternativamente, puede ser posible la colaboración con un investigador o una instalación central para proyectos pequeños. También puede ser necesario entrenar en radiación, ya que los SEM generan rayos X. - Para obtener imágenes de las muestras, utilice los siguientes ajustes: 2,25 kV, con una resolución de 5 a 10 nm/píxel, con tamaños de campo entre 80 y 250 μm en x,y (otros tamaños de campo posibles) y un grosor de corte de 50 a 100 nm, con un total de 250 a 600 cortes en un período de tiempo de 16 a 20 horas.
Nota: Los ajustes varían sustancialmente entre los diferentes microscopios, muestras individuales y la resolución deseada. Estos ajustes deben producir imágenes que sean fácilmente interpretables para muchas muestras.
2. Análisis del conjunto de datos de imágenes
Nota: El software Image J/Fiji se utiliza para analizar el conjunto de datos y se basa en el complemento TrakEM2. Los pasos de preprocesamiento se pueden realizar utilizando una variedad de software y pueden ser extensos o menores dependiendo del nivel de experiencia y las pilas obtenidas. Aquí se describen las principales transformaciones utilizando el software de código abierto (ImageJ ver 1.50b, descarga FIJI Oct 1, 2015).
- Convierta imágenes a formato tiff de 8 bits desde las imágenes originales propietarias de 16 bits abriendo el software y seleccionando los elementos de menú Tipo →de imagen→8 bits.
- Si la conversión automática de contraste/brillo durante este paso no es ideal para las imágenes, vuelva a abrir las imágenes de 16 bits y pulse Imagen→Ajustar→Brillo/Contraste. Seleccione un rango que funcione para todas las imágenes y presione Aplicar. A continuación, realice la conversión. Nota: En algunos SEMs, este paso puede requerir el software del fabricante del microscopio.
- Si es necesario, debido a un movimiento inaceptable de la imagen entre los sectores (e.g. deriva debido a la carga), registre/alinee las pilas de imágenes (elementos de menú Plugins→Registration→Linear StackAlignmentWithSIFT). En la mayoría del software de registro, se establece en el modo "solo traducción" en lugar de "cuerpo rígido".
Nota: Muchos enfoques y software pueden funcionar: el plug-in de registro SIFT funciona para muchas aplicaciones y hay una versión de pila virtual. - Si es necesario, amplíe el tamaño del lienzo antes del registro (Image→Adjust→CanvasSize) o redúzcalo a un área de interés (Image→Crop).
Nota: Es posible que se produzcan algunos desvíos o separaciones, y probar otros complementos o software puede producir mejores resultados. Las opciones manuales también están disponibles (e.g. ImageJ/FIJI, Plugins→Registration→ManualLandmarkSelection).
- Si lo desea, escale las imágenes a un tamaño más pequeño y manejable (e.g. 25%) usando ImageJ (Image→Scale).