Identificación de subtipos de células ganglionares de la retina de ratón mediante trazado fluorescente

Resumen

Fuente: Laboissonniere, et. al. Secuenciación de ARN unicelular de subconjuntos definidos de células ganglionares de la retina. J. Vis. Exp. (2017).

Este video muestra una técnica de trazado fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares de la retina (RGC) en la retina de un ratón transgénico. El proceso consiste en asegurar la retina aislada en una cámara de registro, mantener la viabilidad celular con perfusión oxigenada y dirigirse a las RGC marcadas con fluorescencia utilizando una pipeta con un trazador. Mediante el análisis de la morfología y estratificación dendrítica, el método permite clasificar distintos subtipos de RGC.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por la revisión ética animal apropiada.

1. Preparación del tejido retiniano (2 h)

NOTA: Todos los procedimientos de esta sección deben realizarse bajo una iluminación roja tenue

1. Animales adaptados a la oscuridad durante al menos 1 h antes de la disección. Realice todos los procedimientos bajo una luz roja tenue.
2. Sacrificar a los animales por asfixia por CO₂ asfixia y enuclear los globos oculares en una placa de Petri con solución extracelular previamente oxigenada.
3. Pinche la córnea con una aguja y córtela cortándola con unas tijeras oftálmicas en el borde de la córnea y la esclerótica.
4. Retire la lente con pinzas #5. Haga suavemente un desgarro en la esclerótica con las pinzas y corte el nervio óptico donde se unen la retina y la esclerótica. Termine con cuidado de retirar la esclerótica de la retina.
5. Retire el vítreo transparente con pinzas #5; Una vez extraído, el vítreo aparece como una sustancia gelatinosa adherida a las pinzas. Cortar las retinas por la mitad (de modo que queden 4 piezas/animal) y almacenarlas en solución extracelular oxigenada a RT hasta su uso.
6. Cuando esté listo para montar el tejido en la cámara de registro, coloque un trozo de retina para incubar en una solución enzimática diluida en 500 μL de solución extracelular oxigenada. Incubar en una placa de Petri durante 2 minutos a temperatura ambiente (RT) en un agitador.
   1. Lave el trozo de retina en una solución extracelular oxigenada y coloque el tejido en una cámara de registro con fondo de vidrio; Utilice una pipeta de transferencia de plástico con la punta cortada para permitir que la retina se transfiera sin causar daño al tejido.
7. Use fórceps para aplanar cuidadosamente el tejido con la capa de fotorreceptores hacia abajo. Retire el exceso de líquido con una pipeta. Ancla el pañuelo con un anillo de platino con malla de nylon.
   NOTA: Este método también podría usarse para preparar el tejido para el aislamiento de ARN de células amacrinas y bipolares marcadas.
8. Llene la cámara con solución extracelular oxigenada y móntela en una platina de microscopio. Perfundir tejido con solución extracelular oxigenada a 2-4 mL/min.

3. Visualización y focalización de las células ganglionares de la retina GFP+ (10 min)

NOTA: Todos los procedimientos de esta sección deben realizarse bajo una iluminación roja tenue

1. Antes de comenzar, Micropipetas de vidrio de tracción (diámetro exterior [OD]: 1,2 mm, diámetro interior [ID]: 0,69 mm) para registros electrofisiológicos con un extractor de micropipetas. Utilice el siguiente protocolo para los electrodos (tenga en cuenta que los parámetros deben ajustarse en consecuencia para lograr la resistencia deseada y variarán según los extractores y con diferentes vidrios): Calor: Rampa +10; Tirón: 0; Vel: 23; Retraso: 1; Presión: 500; Bucle de programa: 5 veces. Asegúrese de que las puntas tengan ~1 μm de diámetro, con resistencias de 2-4 MΩ para apuntar a celdas grandes y de 5-7 MΩ para apuntar a celdas más pequeñas.
2. Observe la capa de células ganglionares utilizando la óptica de contraste de interferencia diferencial infrarroja (IR-DIC) (Figura 1A). Identifique la proteína fluorescente verde (GFP) + las células ganglionares de la retina (RGC) mediante epifluorescencia (~480 nm) (Figura 1B).
3. Localice la pipeta llena de solución intracelular en DIC. Aplique una ligera presión positiva y compensaciones de voltaje cero en el amplificador.
4. Presione la micropipeta de vidrio contra una célula GFP+ y aplique presión negativa para formar un sello GΩ entre la pipeta y la membrana celular. Aplique los pasos del comando de voltaje de prueba (e.g., 5 mV) para monitorear la resistencia del sello. Después de formar un sello estable, rompa la membrana aplicando breves pulsos de presión negativa para obtener acceso a toda la célula.
5. Espere 1-2 minutos para que las dendritas de la célula se llenen de trazador fluorescente.
   NOTA: La célula se puede tipificar morfológicamente examinando la morfología en la epifluorescencia (Figura 1C). En el caso de las RGC que expresan melanopsina, la estratificación dendrítica en la capa plexiforme interna se visualiza examinando las dendritas llenas de trazador fluorescente bajo iluminación epifluorescente y determinando si se estratifican lejos del soma en la sublámina OFF (M1 ipRGCs), cerca de la capa de células ganglionares en la sublámina ON (M2 y M4 ipRGCs), o ambas (M3 ipRGCs). Esta observación, combinada con el tamaño del soma (los M4 tienen somas claramente grandes en comparación con todos los demás subtipos de ipRGC), permite la identificación del tipo de célula. Por lo tanto, esta técnica permite la identificación del tipo de célula in vitro antes del aislamiento del ARN. Este método podría modificarse para otros protocolos de identificación de tipos celulares que involucran la morfología dendrítica o la fisiología celular.

Resultados

Figura 1: Identificación de t...

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