Imágenes de fotoactivación de fluorescencia del transporte de neurofilamentos en axones de ratón mielinizados

Resumen

Fuente: Boyer, N. P. et. al., Imagen y análisis del transporte de neurofilamentos en el nervio tibial de ratón extirpado. J. Vis. Exp. (2020)

Este video muestra el método de fotoactivación de fluorescencia para analizar Transporte de neurofilamentos en axones mielinizados de nervios periféricos. Mediante el seguimiento de neurofilamentos marcados con fluoróforos verdes fotoactivados, la técnica proporciona información sobre el transporte axonal en enfermedades neurodegenerativas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de solución salina para nervios

1. Haga 100 mL de solución salina de Breuer: 98 mM de cloruro de sodio (NaCl), 1 mM de cloruro de potasio (KCl), 2 mM de fosfato de dihidrógeno de potasio (KH₂PO₄), 1 mM de sulfato de magnesio (MgSO₄), 1,5 mM de cloruro de calcio (CaCl₂), 5,6% de D-glucosa, 23,8 mM de bicarbonato de sodio (NaHCO₃) en agua bidestilada.
2. Burbujee 95% de oxígeno/5% de dióxido de carbono (carbógeno) a través de la solución salina durante al menos 30 minutos antes de usar. La solución salina sobrante se puede reutilizar en una semana; sin embargo, debe reoxigenarse antes de cada uso.
3. Vierta solución salina oxigenada en una jeringa de 60 ml y asegúrese de que quede un mínimo de aire en la jeringa.

2. Montaje inicial de la cámara de perfusión nerviosa

1. Conecte la jeringa y el tubo como se muestra en Figura 1A, colocando el tubo de salida en un matraz de desecho.
2. Coloque la junta exterior en la carcasa de la cámara de perfusión, asegurándose de que los postes de entrada y salida de flujo estén alineados con los orificios de la junta.
3. Coloque la junta interior (silicona, 100 μm de grosor) sobre un cubreobjetos circular #1.5 (40 mm de diámetro), alisando cuidadosamente las arrugas de la junta para garantizar un sellado hermético. Para facilitar el montaje posterior, coloque el cubreobjetos y la junta sobre una toalla de papel o una toallita de trabajo con la junta hacia arriba.

3. Disección y preparación del nervio tibial del ratón

1. Sacrificar al animal por inhalación de dióxido de carbono u otro método aprobado institucionalmente. Inicie un temporizador cuando el animal deje de moverse/respirar, ya que los experimentos solo deben realizarse dentro de las 3 horas posteriores al sacrificio.
2. Rocíe el pelaje con etanol al 70% y elimine la mayor cantidad posible de las patas y la espalda del animal con una maquinilla de afeitar eléctrica.
3. Con un par de tijeras de disección grandes, haga una incisión dorsal en la piel cerca de la mitad de la columna vertebral y continúe el corte alrededor de la cara ventral del animal. A partir de este corte, refleje lentamente la piel de las piernas tirando suavemente de ella lejos del músculo y cortando la fascia.
4. Coloque al animal en posición supina sobre una bandeja de disección y sujete las cuatro patas con alfileres. Opcionalmente, sujete la cola para reducir aún más el movimiento.
5. Con unas tijeras de microdisección, haga una incisión en los músculos del muslo a medio camino entre la cola y la rodilla para exponer el nervio ciático. Asegúrese de que el nervio, que es visible a través del músculo, no se corte.
6. Extienda la incisión dorsal y ventralmente para extraer el músculo. Del mismo modo, retire los músculos de la pantorrilla, manteniendo los cortes poco profundos y cortos para evitar dañar los nervios.
7. Retire los músculos hasta que el nervio tibial esté completamente expuesto desde el punto donde se ramifica desde el nervio ciático (en la rodilla) hasta el talón (Figura 2A).
   NOTA: En todos los pasos, incluyendo y después de la disección del nervio tibial, evite la exposición innecesaria a la luz ambiental para minimizar la posible activación incidental de la proteína fluorescente verde fotoactivable (paGFP) en el nervio.
8. Agarre el nervio tibial en el extremo proximal de la columna vertebral con un par de pinzas y corte el nervio con un par de tijeras de microdisección. Teniendo cuidado de no poner tensión en el nervio, levántelo lejos del músculo, cortando cualquier inserción.
9. Corte el extremo distal de la columna vertebral del nervio tibial y transfiéralo a una pequeña placa de Petri de solución salina oxigenada a temperatura ambiente. A partir de este punto del procedimiento, asegúrese siempre de realizar un seguimiento de los extremos proximal y distal del nervio.
   NOTA: Una forma de hacer esto es marcar el extremo distal del nervio con un corte en ángulo de tal manera que la conicidad sea visible.
10. Comenzando desde el extremo proximal del nervio, agarre suavemente los extremos expuestos del axón con un par de pinzas de punta muy fina.
11. Con un segundo par de fórceps, agarre la vaina nerviosa proximalmente y tire lentamente hacia el extremo distal del nervio. La vaina nerviosa se deslizará a lo largo de los axones con una resistencia mínima. Asegúrese de que no se aplique una tensión excesiva al nervio durante este proceso.

4. Montaje de la cámara de perfusión nerviosa final

1. Agarrando el extremo proximal del nervio, retírelo de la solución salina y colóquelo lentamente sobre el cubreobjetos de la cámara de perfusión dentro de la abertura rectangular de la junta interna, manteniendo una tensión suave sobre el nervio mientras lo acuesta para que quede recto.
2. Coloque el portaobjetos del microacueducto sobre el nervio con el lado ranurado hacia el nervio y la dirección del flujo paralela al nervio. Dé la vuelta al cubreobjetos y al conjunto del microacueducto, y colóquelo dentro de la carcasa de la cámara de perfusión con el portaobjetos del microacueducto colocado en la junta exterior. El nervio y la junta interior circundante ahora se intercalarán entre el cubreobjetos y el portaobjetos del microacueducto, que están separados por la junta, con el cubreobjetos hacia arriba (Figura 1B).
3. Asegure la cámara de perfusión colocándola en la carcasa metálica y girando el anillo de bloqueo. Asegúrese de que la carcasa de plástico esté completamente debajo de todos los clips metálicos y apriétela bien para evitar fugas de solución salina. Un apriete excesivo puede agrietar el portaobjetos o el cubreobjetos del microacueducto. Dale la vuelta a la cámara para que el cubreobjetos quede hacia abajo.
4. Presione lentamente el émbolo de la jeringa salina para llenar la cámara de perfusión. Mantenga el tubo de entrada y salida, el matraz de salida y la jeringa elevados por encima de la cámara en todo momento durante la configuración y la obtención de imágenes. Esto evita el sifón, que puede introducir burbujas o causar inestabilidad en el enfoque debido a la presión negativa en la cámara.
5. Transfiera el conjunto de perfusión a una platina de microscopio invertido y monte la jeringa de solución salina en la bomba de jeringa. Arranque el motor a una velocidad adecuada para un caudal de 0,25 mL/min. A continuación, conecte y encienda el calentador de solución en línea ajustado a 37 °C.
6. Conecte el calentador del objetivo y ajústelo a 37 °C, aplique aceite al objetivo e inserte la cámara de perfusión en el soporte de la plataforma.
7. Aplique aceite a la almohadilla calefactora de la cámara y conéctela a la cámara de perfusión. Conecte y encienda el calentador de cámara; ajustado a 37 °C.
   NOTA: Los cambios de temperatura pueden hacer que se formen burbujas en la cámara de perfusión debido a la desgasificación de la solución. Si se forman burbujas, aumente brevemente el caudal de la solución de 5 a 10 veces hasta que las burbujas salgan de la cámara.
8. Bloquee la cámara de perfusión en el adaptador de platina y ponga el aceite del objetivo en contacto con el cubreobjetos en la parte inferior de la cámara.
   NOTA: La cámara Bioptechs con adaptador de platina ASI utilizada aquí está diseñada para una configuración de microscopio invertido.

5. Activación de fluorescencia y adquisición de imágenes

1. Usando iluminación de campo claro, concéntrese en la capa de axones en la superficie inferior del nervio más cercana a la superficie de cubreobjetos (Figura 2B). Los axones mielinizados (típicamente de 1 a 6 μm de diámetro en ratones adultos) se pueden identificar por la presencia de una vaina de mielina, que es visible bajo la iluminación de luz transmitida de campo claro sin realce de contraste. Las hendiduras de Schmidt-Lanterman y los nudos de Ranvier también son evidentes. Los axones no mielinizados son más delgados (típicamente de <1 μm de diámetro) y generalmente están presentes en haces (haces Remak), donde generalmente están demasiado unidos para ser resueltos entre sí.
2. Si está disponible en el microscopio, active el sistema de enfoque automático para mantener el enfoque en el transcurso de las imágenes de lapso de tiempo.
3. Adquiera una imagen de referencia de campo claro. Registre la orientación del nervio (extremos proximal y distal de la columna vertebral) con respecto a las imágenes.
4. Adquiera una imagen confocal utilizando un láser de 488 nm y un filtro de emisión apropiado para paGFP (por ejemplo, 525/50 nm) para registrar la autofluorescencia previa al blanqueo. Mantenga la potencia del láser baja para minimizar el fotoblanqueo, con el tiempo de exposición ajustado en consecuencia para detectar la señal débil. A modo de ejemplo, se adquirieron datos representativos con una potencia láser del 5% y exposiciones de 4 s. Registre la configuración de adquisición para su uso en todos los experimentos futuros.
   NOTA: Después de la fotoactivación, la configuración de imagen ideal producirá una relación señal-ruido > 8 y un fotoblanqueo de menos del 25% de la señal original en el transcurso de 20 imágenes. Los axones también se pueden visualizar mediante microscopía de epifluorescencia de campo amplio como lo hicimos originalmente, pero la calidad de la imagen será inferior debido a la falta de confocalidad.
5. Ajuste la potencia del láser a aproximadamente 5 veces la potencia de imagen normal y adquiera una imagen con un tiempo de exposición de 3-4 minutos. Aunque no es esencial, este paso se recomienda para blanquear la autofluorescencia y otras fuentes de fluorescencia no deseada con el fin de reducir la señal de fondo y, por lo tanto, maximizar la relación señal-ruido de la fluorescencia fotoactivada.
6. Adquiera una imagen con los ajustes utilizados en el paso 5.4 para registrar la autofluorescencia previa a la activación después de este paso de blanqueo.
7. En la imagen de campo claro, dibuje una línea paralela a los axones con una longitud igual al tamaño deseado de la ventana de activación. La longitud de esta ventana variará en función del objetivo experimental y los parámetros, pero las longitudes típicas son de 5 μm para el paradigma de escape de pulsos y de 40 μm para el paradigma de dispersión de pulsos.
8. Usando esta línea como guía, dibuje una región rectangular de interés (ROI) a través del campo de visión perpendicular a los axones. La región debe abarcar todos los axones para ser fotoactivados.
9. Determine la configuración óptima para la fotoactivación con iluminación de 405 nm.
   NOTA: Solo realice este paso y los subpasos antes de la primera activación experimental. En el transcurso de un experimento, se deben utilizar los mismos ajustes de fotoactivación.
   1. Active una región de interés repetidamente utilizando la línea láser de 405 nm, baja potencia de láser (p. ej., 5 %) y tiempo de permanencia de píxeles (p. ej., 40 μs), y un pulso, adquiriendo una imagen de la proteína fluorescente verde activada o fluorescencia GFP después de cada activación. Repita hasta que la fluorescencia ya no aumente y, a continuación, cuantifique la fluorescencia en una región de interés para cada imagen.
   2. Represente las intensidades de fluorescencia medias en función del número de pulsos. Seleccione el número de pulsos después de los cuales la fluorescencia ya no aumenta como el número óptimo de pulsos para la activación.
10. Active la fluorescencia paGFP en la región dibujada en el paso 5.8 mediante excitación con patrón con luz de 405 nm. Asegúrese de que una imagen se adquiera justo antes y después de la activación.
    NOTA: La activación ideal de paGFP producirá una región de fluorescencia claramente definida con límites nítidos contenidos dentro de la región de interés o ROI.
11. Inicie un temporizador de 1 minuto cuando finalice la activación. Al final de 1 minuto, inicie la adquisición de una serie de lapso de tiempo.
    NOTA: El retraso de 1 minuto es necesario para permitir el aumento de la fluorescencia que se observa después de la fotoactivación de la paGFP. Para el método de dispersión de pulsos, un período de adquisición de 5 a 10 minutos con intervalos de lapso de tiempo de 30 segundos es suficiente para medir las pendientes iniciales en las ventanas central y flanqueante para medir la velocidad y la direccionalidad. Para el método de escape de pulsos, un período de adquisición de 30-150 minutos con intervalos de lapso de tiempo de 5 o 10 minutos permite analizar el comportamiento de pausa a largo plazo de los filamentos.
12. Guarde todas las imágenes adquiridas, así como el ROI utilizado para la activación de la fluorescencia.
13. Muévase a una nueva región del nervio y repita los pasos 5.1-5.11. Si la nueva región se encuentra a lo largo del mismo axón, debe estar al menos a 500 μm de la región previamente activada para evitar la detección de neurofilamentos fluorescentes que se movieron fuera de la otra región activada. La adquisición del timelapse final debe finalizar antes de que finalice la ventana de 3 horas.
    NOTA: Es posible que la preparación sea viable durante más de 3 horas, pero no lo hemos confirmado. Con una disección y preparación competentes, se pueden adquirir entre cinco y ocho conjuntos de imágenes de lapso de tiempo de 10 minutos dentro de esta ventana de 3 horas.
14. Una vez adquirida la serie final de imágenes de lapso de tiempo, detenga el flujo de solución salina, desconecte la solución y los calentadores de la cámara, y retire el aparato de perfusión de la etapa del microscopio.

Resultados

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
14 x 22 Junta rectangular 0.1mm	Bioptechs	1907-1422-100	Inner gasket
2-desoxi-D-glucosa	Sigma	D6134
30mm Junta redonda con agujeros	Bioptechs	1907-08-750	Outer gasket
35 x 10mm dish	Thermo Fisher	153066	Dissection dish
40mm cubreobjetos redondos	Bioptechs	40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip	BD	309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system confocal	Andor		Equipado con los sistemas Perfect Focus y FRAPPA
Lcium chloride	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	For fluorescein slide
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
Diseccionando pines	Fine Science Tools	26001-70
Pinzas de disección	Fine Science Tools	11251-30	Pinzas de punta fina
Dissection microscope	Zeiss	47 50 03
Bandeja de disección con cera	Ginsberg Scientific	568859
Tijeras de disección	Fine Science Tools	14061-09	Tijeras de disección inicial
FCS2 perfusion chamber	Bioptechs	60319-02-03
Fluoresceína sódica	Fluka	46960
Inline solution heater	Warner Instruments	SH27-B
Pinzas de laminectomía	Fine Science Tools	11223-20	Pinzas de disección inicial
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Microaqueduct slide	Bioptechs	130119-5
Microscope slides	Fisher	12-544-3	For fluorescein slide
Inserto de etapa de microscopio	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
Sistema de calentamiento de objetivos	Okolab		Oko Touch con collar objetivo
Objective oil - type A	Nikon	discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objetivo	Nikon	MRD01901
Cloruro de potasio	Fisher	P217
Fosfato de potasio	Sigma-Aldrich	P0662
Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich	S6297
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S7653
Bomba de jeringa	Sage Instruments	Model 355
Adaptador de tubo - hembra	Small Parts Inc.	1005109
Adaptador de tubo - macho	Small Parts Inc.	1005012
Tygon tubing	Bioptechs		1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	fine scissors