Microscopía de dos fotones para obtener imágenes de la morfología neuronal en una cría de ratón

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y el veterinario JoVE <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>

1. Preparación de la ventana craneal

1. Anestesiar al cachorro con isoflurano (1.0% - 2.0%) y comprobar el nivel de anestesia mediante una prueba de pellizco de cola.
2. Abra cuidadosamente el cráneo con una cuchilla de afeitar esterilizada dejando intacta la duramadre (1 mm de diámetro) (Figure 1C). Utilice una esponja de gelatina (cortada en trozos pequeños, de aproximadamente < 2 mm3, con tijeras esterilizadas, y aplíquelos con pinzas) empapada en tampón de corteza (125 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, 10 mmol/L glucosa, 10 mmol/L HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico), 2 mmol/L CaCl₂, and 2 mmol/L MgSO₄; pH 7.4; 300 mOsm/L; temperatura ambiente) para detener la hemorragia. Al abrir el cráneo, aplique un tampón de la corteza para mantener húmeda la superficie del cerebro.
3. Con una esponja de gelatina, elimine el tampón y la sangre de la superficie dural. Con puntas amarillas, aplique una capa delgada de agarosa de bajo punto de fusión al 1,0% (disuelta en el tampón de corteza). Usando una máquina de bloques de calor, mantenga la temperatura de la solución de agarosa a 42 ° C hasta la aplicación.
   NOTA: El drenaje del tampón y la sangre debe realizarse desde el lado de la craneotomía teniendo cuidado de que la esponja de gelatina seca no entre en contacto con la duramadre. Si no lo hace, puede dañar la duramadre.
4. Aplique un cubreobjetos redondo de vidrio (nº 1, de 3 mm de diámetro) sobre la capa de gel de agarosa. Retire todas las burbujas entre el cubreobjetos y la capa de gel de agarosa vertiendo un exceso de gel de agarosa entre ellas. Retire el exceso de gel que sobresale de debajo del cubreobjetos con pinzas (Figure 1D y1E).
5. Asegure el cubreobjetos con cemento dental (Figure 1F).
6. Mezcle el cemento en polvo y el cemento líquido. Aplique la mezcla con puntas amarillas antes de que se solidifique. No aplique cemento dental en la duramadre, ya que esto puede dañar el cerebro.
7. Coloque una barra de titanio estéril (hecha a medida, aproximadamente 30 mg, consulte Figure 1G) en el hueso craneal con cemento dental. Alinee la barra de titanio y el cubreobjetos (en la superficie de la duramadre) en paralelo para capturar imágenes fácilmente.
8. Cubra el cráneo expuesto con cemento dental (Figure 1H).
9. Recupera al cachorro de la anestesia. Manténgalo en un calentador (37 °C) hasta que el cemento dental se haya solidificado (1 h).

2. Two-photon Imaging

1. Establezca la longitud de onda del láser de dos fotones. Para la excitación RFP (proteína fluorescente roja), utilice 1.000 nm (450 mW/mm2 a 400 μm de profundidad).
   NOTE: El poder del láser debe reducirse a medida que la posición z se mueve hacia arriba.
2. Limpie la superficie del cubreobjetos con etanol al 70%.
3. Anestesiar al cachorro con isoflurano (1,5% - 2,0%) y comprobar el nivel de anestesia mediante una prueba de pellizco de la cola.
4. Fije el cachorro a la placa de titanio en la etapa de imagen usando una barra de titanio en la cabeza del cachorro (Figura 2A and 2B). Ajuste la cabeza de modo que el cubreobjetos quede paralelo a la lente del objetivo utilizando la etapa del goniómetro (Figure 2B). Mantenga la temperatura corporal del cachorro usando una almohadilla térmica (37 °C).
5. Ajuste la concentración de isoflurano a 0.7% - 1.0%.
   NOTE: Una concentración muy alta de isoflurano puede causar la muerte accidental del cachorro durante la toma de imágenes.
6. Coloque la etapa de imagen debajo de la lente del objetivo (20X, NA 1.0) del microscopio de dos fotones (Figure 2B and 2C).
7. Aplique una gota de agua sobre el cubreobjetos. Utilice la epifluorescencia para localizar las neuronas marcadas con proteínas fluorescentes en el área donde se ha expuesto la duramadre.
8. Adquiera imágenes de pila z a intervalos de 1,4 μm. Para la obtención de imágenes de neuronas de capa 4, establezca el ancho z en 150 - 300 μm para obtener una imagen de toda la morfología dendrítica (Figure 2D y 2E). Utilice el escaneo lento y el promedio para obtener imágenes claras que muestren la morfología neuronal (por lo general, se necesitan > 20 minutos para adquirir la morfología dendrítica completa).
   NOTA: Se recomiendan los siguientes parámetros para la obtención de imágenes. Longitud de onda de excitación: 1.000 nm, escáner: tipo galvanómetro, espejo dicroico: 690 nm, filtro de emisión: paso de banda de 575 - 620 nm, detector: tipo GaAsP, ajuste de ganancia > 100, tamaño de imagen > 512 x 512 μm, campo de visión > 600 x 600 μm, resolución de píxeles < 1,2 μm.

Figura 1: Cirugía, ventana craneal Preparación y fijación de la barra de titanio. (A) Este panel muestra la remoción de la piel que cubre el cráneo. (B) Este panel muestra la fijación del espacio entre la piel y el cráneo. Tenga cuidado de no aplicar el adhesivo en el área de la imagen. (C) Esta es una imagen de la duramadre expuesta. Se insertó una hoja de afeitar entre el cráneo y la duramadre, y el cráneo se abrió a la izquierda del área expuesta (punta de flecha). Luego, el hueso se puede extraer fácilmente con pinzas. (D) Este es un diseño esquemático que muestra una vista vertical de la ventana craneal. El espacio entre el cubreobjetos y la duramadre se rellena con una fina capa de gel de agarosa. El cubreobjetos se fija al cráneo mediante cemento dental. (E) Se coloca un cubreobjetos de forma redonda sobre la capa de gel de agarosa. (F) Esta es una imagen de la cubreobjetos asegurada. (G) Este panel muestra el diseño de la barra de titanio. La barra de titanio contiene dos orificios para tornillos para la fijación a la platina de imágenes (consulte la Figura 2) y una parte rectangular plana que se une a la cabeza del cachorro. (H) La parte rectangular de la barra de titanio se une al cráneo del cachorro con cemento dental.

Figura 2: In vivo imágenes de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatos. (A) Este panel muestra el diseño de la placa de titanio. La placa de titanio tiene dos orificios para tornillos para sujetar la barra de titanio y cuatro orificios para tornillos para fijar la platina del goniómetro, que se coloca en la platina de imagen. Para la fijación se utilizan tornillos de 2,5 mm (de diámetro) x 2 mm (de longitud). (B) Esta es una imagen representativa del cachorro adjunta a la etapa de imagen. La temperatura corporal del cachorro se mantiene mediante un calentador. (C) El cachorro es anestesiado con isoflurano durante el procedimiento de imagen in vivo procedimiento de imagen. (D) Este panel muestra una imagen representativa de lapso de tiempo de pila Z de las neuronas corticales de la capa 4 de un cachorro P5. La punta de flecha indica la neurona con dendritas borrosas, que deben eliminarse del análisis. (E) Este panel muestra imágenes de lapso de tiempo de mayor aumento de la neurona con flechas en el panel D. Puntas de flecha azules: puntas dendríticas que se retraen en 4,5 h, puntas de flecha amarillas: puntas dendríticas que se alargan en 4,5 h, pequeñas puntas de flecha blancas: axón de una célula vecina. (F) Este es un modelo 3-D de la traza dendrítica de la neurona en la figura izquierda del panel E. Los círculos azules indican la posición del cuerpo de la célula. (G) Este panel muestra neuronas representativas con dendritas desconectadas, que no se incluyen en el análisis. Los datos de muestra en los paneles D - G contienen neuronas noqueadas NR1 (una subunidad esencial del receptor de glutamato de tipo NMDA) (debido a los datos limitados disponibles de los autores).