Imágenes de bioluminiscencia para el estudio de transitorios de calcio en estructuras cerebrales de Drosophila

Resumen

Source: Lark, A. R., et. al., enfoque de imágenes cerebrales funcionales in vivo basado en el indicador de calcio bioluminiscente GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra imágenes en tiempo real de la dinámica del calcio utilizando la bioluminiscencia de proteína fluorescente verde-aequorina en Drosophila's estructuras cerebrales profundas.

Protocolo

1. Imagen

1. Setup
   1. Inicie el sistema de grabación encendiendo el microscopio, la computadora, la cámara y el sistema de drenaje y ajustando los controles ambientales de la habitación a 25 °C.
   2. Abra la medición y Programa Automation Explorer en el ordenador. Haga clic en "Dispositivos e interfaces", luego haga doble clic en "NI Motion Devices" y finalmente haga clic derecho en "PCI-7334" y seleccione "inicializar dispositivo".
   3. Abra Photon Imager. Cree una nueva carpeta y asigne un nombre al primer archivo de grabación. La cámara debe alcanzar los -80 °C para que el sistema funcione.
   4. Configure el sistema de perfusión: Agregue KCl (cloruro de potasio), nicotina y solución de Ringer a los depósitos y ajuste para que cada solución se descargue a 2 ml/min. Lávese con la solución de Ringer antes de comenzar el experimento.
2. Prepare la muestra
   1. Coloque la placa de bloque de la montura de imagen en la montura bajo un microscopio con un aumento de 5X e inserte el tubo de perfusión en el canal a través de la punción.
   2. Ponga el microscopio en modo fluorescente, luego centre y enfoque los cuerpos de los hongos (MB). Ajuste a 20X, vuelva a centrar y enfoque.
   3. Coloque el aparato de drenaje sobre la piscina de drenaje, ajuste la altura de la derivación de drenaje de modo que la punta quede justo por encima de la piscina y ejecute la solución de Ringer durante 30 segundos para garantizar un drenaje adecuado.
   4. Tire hacia abajo del escudo para sellar el aparato de la luz. Utilizando el sistema automatizado en el generador de imágenes de fotones, realice ajustes finos en el enfoque y tome una imagen fluorescente de referencia de los MB.
3. Grabación
   1. Ajuste la velocidad del fotón a la velocidad de grabación deseada (desde 50 mseg hasta 1 seg o más). Seleccione el modo de fotón y abra el obturador. Registre el genotipo, el sexo, la edad y el número de muestra en las entradas del registro. Ajuste la posición de los cuadros ROI (región de interés) sobre el cáliz y los cuerpos celulares (CCB) y los lóbulos mediales haciendo clic en los cuadros de ROI y arrastrando mientras mantiene presionado el control.
   2. Registre la línea de base durante aproximadamente 5 a 10 minutos (según lo desee).
   3. Aplica nicotina durante 1 min. Anote inicio/parada en el registro. Lavar con la solución de Ringer durante 5 min.
   4. Espere 5 min para la recuperación y prepare la entrada de registro de KCl (cloruro de potasio) y el temporizador.
   5. Aplicar KCl durante 1 min. Anote inicio/parada en el registro. Lavar con la solución de Ringer durante 1 min.
   6. Cambie al modo fluorescente, tome la imagen fluorescente final y apague la solución de Ringer.
   7. Presione "Detener" y un cuadro de diálogo le preguntará si desea apagar el sistema. Seleccione "No" para continuar grabando.
   8. Abra el escudo, mueva el sistema de drenaje, cambie el objetivo de la lente a 5X y retire el tubo de perfusión. Retire la placa de muestra/grabación de la platina y limpie la lente 20X enjuagando y limpiando la lente dos veces con agua.
   9. Presione el botón blanco de reproducción en la parte superior de la ventana del programa para iniciar la siguiente grabación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Lcium chloride	Merck	1023911000
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9
Potassium chloride	Prolabo	26 764.298
Magnesium chloride	Prolabo	25 108.295
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S0389
Nicotine	Sigma-Aldrich	N3876
ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Adenosine 5′-trifosfato sódico sódico salt hydrate
Benzyl-coelenterazine	Prolume, nanolight	Cat #301 Coelenterazine h	http://www.prolume.com/
Puntas de pipeta	Corning Incorporated	4868	100-1000μL Univesal Pipette Tip
EM-CCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV	iXon (enfriado a -80°C)
Microscope	Nikon	N/A	Eclipse-E800
Immersion objective lens	Nikon	N/A	20x Fluor .5w
Microscopio de disección con fluorescencia	Leica MZ Fl III	N/A	Leica dissection scope and florescent lamp
Bomba peristáltica	Gilson	N/A	Minipuls 2
Tubing	Fisher Scientific	Depends on thickness	Tygon R3603, St-Gobain
Perfusion system	Warner	64-0135 (VC-66CS)	Sistema de control de válvulas de perfusión, completo, con válvulas de manguito, 6 canales
Perfusion regulators	Leventon	201108	Dosi-flow 3
Measurement and automation explorer	Sciences Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Photon imager	Science Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Photon viewer	Science Wares & National Instuments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel	Microsoft	N/A	software https://www.microsoft.com
Virtual dub	open access	N/A	software http://virtualdub.sourceforge.net/